Возбудитель псевдотуберкулеза по форме клеток относится к палочковидным микроорганизмам, морфология которых зависит от условий культивирования и состояния культуры. Уже отмечалась вариабельность форм и размеров бактериальных клеток. Изменчивы также антигенные и биологические свойства микроба, вирулентность, капсулообразование, форма и строение колоний, активная подвижность, зависящая от наличия или отсутствия флагеллярного аппарата.

Одним из основных признаков изменчивости является диссоциация. По определению В.Д. Белякова и соавт., под термином «диссоциация» понимают расслоение популяции микроорганизмов, однородной по своим свойствам (внешний вид культуры, структура колоний, морфологические, физиологические, биохимические и др. признаки), на два или более типов, отличающихся от исходного, но сохранивших все признаки, позволяющие по-прежнему относить их к одному виду. Показано, что диссоциация возникает в результате мутаций, рекомбинантного процесса, модификаций, а также под влиянием внехромосомных подвижных генетических элементов.

Изучение псевдотуберкулезного микроба позволило сделать вывод, что диссоциативная изменчивость штаммов, выделенных от больных людей и из окружающей среды, не всегда соответствует описанным ранее критериям для различных форм диссоциации и имеет свои особенности. Поскольку считают, что истинный диссоциативный процесс носит мутационный характер и отличается определенной скоростью, Т.Н. Варвашевич предприняла попытку установить природу и частоту перехода S-формы в R-форму у штаммов, выделенных у больных людей, а также найти оптимальные условия, при которых сохраняются первоначальные свойства штаммов (известно, что только S-формы у большинства бактериальных видов обладают вирулентностью и полным комплексом свойств, определяющих специфичность вида).

В работе было изучено 166 штаммов, выделенных от больных псевдотуберкулезом, 160 штаммов, выделенных из овощей, творога, смывов с кухонного инвентаря и оборудования овощехранилищ, 10 музейных культур, выделенных в свое время от больных людей и хранившихся 10 лет на полужидком агаре, а также один эталонный штамм, полученный из Института им. Л. Пастера (Париж) от H.Mollaret. Все изученные штаммы принадлежали серовариантам 1 и 3. Было установлено, что во всех случаях псевдотуберкулезный микроб выделяется из указанных объектов в S-форме. Однако достаточно провести 3—5 пассажей этого штамма при температуре 37 °C на подсушенном агаре, чтобы у них появились новые признаки, свойственные R-форме (характерный вид колоний и роста в бульоне, утрата яркого свечения колоний при просмотре в косом свете, повышенная агглютинабельность в изотоническом растворе хлорида натрия, изменение специфических антигенных свойств, снижение вирулентности). Следует подчеркнуть, что все эти признаки исчезают, когда культуру микроба высевают на свежий, влажный питательный агар и она выращивается при температуре 4—8 °С. При этом через 5—7 пассажей, в зависимости от штамма, культура восстанавливает все свои первоначальные свойства S-формы (табл. 5).

Такие способные к реверсии варианты нами, как и Г.В. Ющенко, называются ложными R-формами (R1) в отличие от истинных R-форм (Rист.), не способных к реверсии в S-формы, получение которых чрезвычайно затруднено. Из всех изученных нами штаммов псевдотуберкулезного микроба лишь один, полученный из института им. Л. Пастера (Париж), после 98 пассажей при температуре 37 °С дал истинную R-форму, которая не реверсировала в процессе длительного пассирования при температуре 4—8 °С в S-форму. Таким образом, ложная R-форма является фенотипическим состоянием, возникающим в результате ненасле-дуемой изменчивости микроба и существующим до тех пор, пока действуют факторы, вызывающие эти изменения. В дальнейших исследованиях была предпринята попытка найти тот температурный диапазон, при котором происходит разделение популяции возбудителя псевдотуберкулеза на S- и R-формы. Использование различных методов не привело к положительным результатам. Количественный высев на питательный агар и подсчет колоний всегда давали однозначные результаты: при температуре 37 °С 100 % колоний были в ложной R-форме, при температуре от 20 до 28 °С — в переходной О-форме (колонии с гладким краем, несколько более матовые, чем S-колонии, отсутствие яркого свечения при косом освещении), и при температуре 4—8 °С все 100 % колоний были в типичной S-форме. Разделить переходную O-форму псевдотуберкулезного микроба на S- и Rл-формы также не удалось. При температуре 20—28 °С все время сохранялось это состояние. Взвесь бактерий, полученных из отдельной О-колонии после разведения и количественного высева на влажный агар с выращиванием при температуре 4—8 °С, давала 100 % колоний в S-форме, а при температуре 37 °C (подсушенный агар) — 100 % колоний Rл-формы. Следует отметить, что переход из ложной Rл-в S-форму происходит в ином температурном интервале, чем переход из Rл- в S-форму.

Известно, что процесс диссоциации сопровождается прежде всего изменением поверхностных структур бактерий. В связи с этим Т.Н. Варвашевич были изучены токсические свойства, антигенная специфичность и дана химическая характеристика поверхностных фракций, выделенных из различных диссоциативных форм псевдотуберкулезного микроба. Установлено, что поверхностные фракции бактерий, находящихся в Rл-форме, обладают слабой токсичностью. Наиболее высокая токсичность отмечена у высокомолекулярной фракции поверхностных комплексов, полученных из бактерий, находящихся в S-форме. Анализ сравнительного химического состава показал, что по мере углубления диссоциативного процесса в поверхностных комплексах псевдотуберкулезного микроба резко увеличивается количество липидов (9,9 ± 0,93 % в бактериях S-формы, 34,1 ± 0,7 % в бактериях Rл-формы) и снижается количество белка (69,4 ± 1,9 % в S-форме, 51,8 ±0,8 % в бактериях Rл-формы). Полученные данные близки к тем, которые установлены для других грамотрицательных бактерий.

По мере углубления диссоциативного процесса антигенный состав поверхностных фракций микроба обедняется. Очищенный ЛПС серовара 1, находящегося в S-форме, выявляется с помощью специфической антисыворотки — в виде четкой двухкомпонентной дуги преципитации в катодной зоне. У бактерий истинной R-формы во всех трех поверхностных фракциях выявлялись те же антигены, но линии были тонкими и укороченными. Это свидетельствует о неполноценности ЛПС. Такая закономерность характерна и для R-формы многих представителей семейства Enterobacteriaceae. В поверхностных антигенных комплексах S-формы, помимо ЛПС, отмечались еще три дополнительные линии преципитации. Ложная R-форма характеризовалась утратой линий, отмеченных у соответствующей фракции S-формы. Анализ иммунофореграмм позволил выявить изменения антигенного состава, происходящие в процессе диссоциации бактерий псевдотуберкулеза, которые выражались в полной (Rист.) частичной (Rл) утрате способности бактерий синтезировать некоторые неизвестные пока антигены. Псевдотуберкулезный микроб в S-форме характеризуется большим набором легкорастворимых антигенных комплексов, обладающих различной диффузионной подвижностью. Процесс изменчивости антигенного состава бактерий псевдотуберкулеза находит свое отражение и в иммунологическом ответе макроорганизма. Так, бактерии авирулентной истинной R-формы, характеризующиеся неполноценным Q-антигеном и отсутствием дополнительных антигенов, присутствующих в S-форме, являются слабым антигенным раздражителем, не стимулируют выработки антител и быстро погибают в фагоцитах. Вирулентные популяции бактерий псевдотуберкулеза, находящиеся в S-форме, обладают способностью размножаться в макрофагах, значительно хуже фагоцитируются и слабее стимулируют синтез IgM- и IgG-антител.

Таким образом, при изучении диссоциативной изменчивости культур возбудителя псевдотуберкулеза, выделенных от больных людей, мы столкнулись с фактом, что этот микроб с большим трудом диссоциирует в истинную R-форму и характер его диссоциации не всегда соответствует сложившимся представлениям об этом явлении. То, что считается у псевдотуберкулезного микроба R-формой, чаще является ложной R-формой — состоянием, возникшим в результате адаптивной изменчивости и существующим до тех пор, пока действуют факторы, вызывающие эти изменения: относительно высокая температура (30—37 °С) и недостаточная влажность. Следует отметить, что похожая временная модификация культур бактерий наблюдается и у представителей других родов (Brucella, Francisella).

По аналогии с другими бактериальными видами можно было предположить, что изменчивость псевдотуберкулезного микроба проявляется не только в диссоциативном процессе, но и связана с возникновением в культурах вариантов, характеризующихся нарушением синтеза антигенных комплексов в поверхностных структурах бактериальной клетки. Для решения этого вопроса был применен метод наблюдения за свечением колоний в косопроходящем свете. Штаммы, выделенные от больных людей, независимо от серологической принадлежности оказались гетерогенными по характеру свечения колоний. Было выявлено 4 сероварианта, характеризующихся определенным типом свечения, условно обозначенных цифрами 1, 2, 3 и 4. Колонии 1-го сероварианта при косом освещении имели равномерно желтый цвет, переходящий по периферии колонии в неяркий оранжевый; колонии 2-го сероварианта были неяркого серого цвета, переходящего по краям в нежно-розовый; колонии 3-го сероварианта были медно-зеленого цвета, переходящего по краям в медно-красный цвет; колонии 4-го варианта характеризовались бледно-голубым свечением по нижнему краю колоний и тускло-желтым по верхнему. При рассеве культуры из колонии, характеризующейся каким-либо свечением, снова наступало разделение на указанные цветовые варианты.

Однако при проведении 12—15 последовательных пассажей на МПА из колонии одного цветового варианта можно было получить снова однородно светящиеся клоны. Все 4 варианта культур бактерий были подвижны при температуре ниже 30 °С, причем особо активной подвижностью отличались клетки 4-го варианта. В клетках 1—3-го серовариантов имелась хорошо выраженная капсула, в клетках 4-го — она была очень незначительной. По своим ферментативным свойствам субкультуры всех 4 вариантов были одинаковыми. Субкультуры первых 3 вариантов агглютинировались иммунными сыворотками до разведений 1:3200—1:6400, а с культурами 4-ш варианта титры антител были на 1—2 разведения ниже. Выделенные варианты различались по своей вирулентности. Наименее вирулентными оказались субкультуры 1-го варианта (ЛД50 — 5,8*10в6—1,5*10в7). Инфекционный процесс при заражении мышей этой субкультурой протекал вяло, и некоторые мыши погибли на 18—30-е сутки. При заражении мышей субкультурой 2-го сероварианта (ЛД50 — 3,3*10в2—1,3*10в3) животные погибли на 10—16-е сутки. Субкультуры 3-ш варианта обусловливали типичную картину инфекционного процесса (ЛД50 — 3,3*10в2—1,3*10в3) и гибель животных на 7—14-е сутки. Наиболее вирулентными оказались субкультуры 4-го варианта, ЛД50 которых, как правило, равнялась 5—10 бактериальным клеткам. Гибель мышей при заражении этой субкультурой наступала на 3—7-е сутки.

Изучение иммуногенных свойств культур различных цветовых вариантов проводили в опытах на неинбредных мышах при однократной и двукратной иммунизации. Защитный эффект учитывали после заражения животных 20 ЛД50 вирулентного штамма спустя 21 день после начала иммунизации. Только культура 1-го, наименее вирулентного сероварианта обладала хорошими иммуногенными свойствами и защищала 90 % мышей при однократной иммунизации и 60 % животных — при двукратной. При многолетнем изучении псевдотуберкулеза мы все время сталкивались с явлением, при котором двукратная иммунизация мышей была менее эффективной, чем однократная. По-видимому, это объясняется сильными аллергизирующими свойствами бактерий. Животные, иммунизированные субкультурой 2-го цветового варианта, почти не приобретали иммунитета и погибали в процессе двукратной иммунизации. Возник вопрос, не состоят ли серо-розовые колонии (2-й вариант) из клеток с более выраженными токсическими и аллергенными свойствами. Исходя из того что поверхностные структуры микроба обусловливают наиболее выраженный токсический эффект, были исследованы токсические свойства капсульной субстанции у всех 4 вариантов, различающихся по свечению колоний. При этом было установлено, что капсульное вещество бактерий 2-го варианта оказывало сильное токсическое действие на белых мышей. Гибель 100 % животных наступала через 18—24 ч от 200 мкг капсульного вещества. Капсульное вещество остальных 3 вариантов обладало меньшей токсичностью. Токсичные субстанции локализуются в высокомолекулярной фракции капсульного вещества. Это было характерно для всех 4 вариантов возбудителя псевдотуберкулеза.

В дальнейшем появилась возможность отбора и селекционирования клонов, содержащих токсичный фактор, локализующийся в капсульной субстанции. С целью более глубокого изучения популяционной изменчивости S-формы псевдотуберкулезного микроба был изучен характер взаимодействия различных вариантов бактерий, полученных при клонировании бактерий из одной колонии, с клетками перитонеального экссудата белых мышей in vitro и in vivo. Это было очень важно, потому что варианты бактерий псевдотуберкулеза, различающиеся по характеру и интенсивности свечения колоний в косопроходящем свете, обладали различными биологическими свойствами (вирулентность, токсичность, иммуногенность), что не могло не влиять на характер инфекционного процесса и на формирование иммунитета. Показано, что задержку миграции фагоцитов к месту введения возбудителя обусловливает только 4-й, наиболее вирулентный серовариант культуры микроба. Выраженное деструктивное действие на клетки экссудата брюшной полости белых мышей оказывали бактерии 3-го и 4-го серовариантов. Процент разрушенных клеток в экссудате мышей, зараженных бактериями 4-го варианта, через 7 ч после введения возбудителя составил 95,7±2,5%, в то время как для мышей, зараженных бактериями 1-го варианта, этот показатель был равен 12,8 ± 1,4 %. Бактерии 2—4-го вариантов слабо фагоцитировались полиморфно-ядерными лейкоцитами (ПМЯЛ) и моноцитами. Таким образом, эксперименты, проведенные со штаммами, выделенными от больных людей, показали, что не все клоны бактерий псевдотуберкулеза, даже полученные из одной клетки, оказывали одинаковое действие на клеточные элементы экссудата брюшной полости белых мышей. Это положение было подтверждено в экспериментах на клетках культуры перитонеальных макрофагов морской свинки. Такая гетерогенность штаммов бактерий псевдотуберкулеза наравне с особенностями организма, по-видимому, может быть одной из причин разной тяжести течения инфекции, возникновения различных клинических форм и рецидивирования болезни.

Известно, что псевдотуберкулезный микроб обладает чувствительностью ко многим антибиотикам. Т.Н. Варвашевич показала популяционную неоднородность штаммов микроба и по этому признаку. Было установлено, что различные по характеру свечения сероварианты характеризуются различной устойчивостью к ряду антибиотиков. Независимо от того, из какого штамма получены цветовые варианты, бактерии 1-го клона всегда были более чувствительными и практически подавлялись большинством использованных антибиотиков, за исключением эритромицина и олеандомицина. Субкультуры же 4-го варианта были наиболее устойчивы ко всем исследованным антибиотикам. Левомицетин (наиболее эффективный препарат при лечении псевдотуберкулеза) оказывал крайне незначительное действие на бактерии 4-го сероварианта. Была снижена чувствительность к левомицетину у бактерий, относящихся ко 2-му сероварианту. В то же время бактерии серовариантов 1 и 3 оказались наиболее чувствительными к левомицетину. Таким образом, изучение колоний при помощи косо направленного света показало, что штаммы, выделенные от больных людей, бактерионосителей, грызунов и из объектов окружающей среды, являются гетерогенными. Цвет колоний в косо направленном свете коррелирует с определенными биологическими свойствами культур, что открывает возможности для селекции необходимых для различных исследований культур с определенными свойствами. Поскольку разные по характеру свечения колоний культуры псевдотуберкулезного микроба обладают различными биологическими свойствами, можно считать, что свойства каждого штамма в целом определяются количественным и качественным составом разных его клонов.

Необходимо отметить, что все штаммы, выделенные из объектов окружающей среды, всегда были однородными по свечению колоний и представляли собой серовариант 3 с характерными биологическими свойствами.

При дальнейших исследованиях Т.Н. Варвашевич и В.Е. Сидорова показали, что популяционная изменчивость псевдотуберкулезного микроба определяется условиями культивирования. Авторы работали со штаммами микроба, выращенными на питательном агаре и находящимися в S-форме, однородными по своему популяционному составу, т.е. состоящими из клеток только 1-го или 3-го цветового сероварианта колоний. После первого пассажа при температуре 8 °C на 2 % грязевом экстракте, богатом гумусом, появилась явно выраженная неоднородность популяции и началось расслоение штаммов на 4 сероварианта. Затем от пассажа к пассажу на грязевой среде стало нарастать число мелких голубых колоний, которые характерны для 4-го цветового сероварианта (более вирулентного, чем остальные сероварианты). К 6-му пассажу число колоний этого сероварианта равнялось 100 %. Каждая питательная среда независимо от характеристики исходного штамма по-разному формировала популяционный состав культур. Динамика нарастания клеток 4-го цветового сероварианта в популяциях микроба в зависимости от среды культивирования представлена на рис. 7. Показатели вирулентности штаммов совпадали с характером изменений популяционного состава культур. Следовательно, температурный фактор и среда обитания определяют выбор альтернативных путей обмена, регулирующего синтез ферментов, и характера биохимических реакций, приводя к адаптивному изменению состава популяции.