В 1983 г. Ф.Н. Шубин показал, что штаммы Y. pseudotuberculosis 1-го и 3-го серовариантов способны при температуре 37 °С формировать на питательном агаре два типа различных по морфологии колоний. Изучение морфологических различий колоний автор проводил под микроскопом при 40-кратном увеличении, в проходящем свете. Было установлено, что штаммы псевдотуберкулезного микроба формировали на питательном агаре мелкие, выпуклые, непрозрачные, зернистые колонии с ровным или бахромчатым узким прозрачным краем. В популяции каждого штамма наряду с описанными типичными колониями выявлялись более крупные, прозрачные гомогенные колонии с ровным краем, легкоотличимые от предыдущих. Учитывая, что колонии первого типа (темные под микроскопом) автор обозначил как T+, а второго типа — как T- (рис. 8), обращает на себя внимание тот факт, что четкие различия между T+- и T--колониями выявляются лишь при условии культивирования микроорганизма при 37 °С. Снижение температуры культивирования до 32 °С значительно уменьшает степень непрозрачности и зернистости Т+-колоний, а при температуре 22 °C Т+-колонии не отличаются от Т_-колоний. При культивировании T+- и Т_-клонов на агаре при температуре 14 °С формируются неотличимые по виду колонии, однако способность формировать T+- и Т--колонии сохраняется и проявляется вновь в условиях культивирования при температуре 37 °С. Следовательно, T+-клон сохраняет способность отщеплять незначительное количество T--клеток. Эти данные, по мнению автора, свидетельствуют о том, что при развитии колоний из Т+-клеток в первых генерациях образуются только T+-клетки. Т--клетки появляются в колониях в более поздних генерациях, и потому их количество всегда меньше, чем Т+-клеток. В то же время в исходной культуре Т+-клона всегда содержится небольшое количество Т--клеток. Изучение морфологии, подвижности, биохимической активности, чувствительности к антибиотикам не выявило различий T+- и Т--клонов. В то же время T+- и Т--клоны различались размерами колоний на питательном агаре и среде Серова. Так, диаметр колоний T+ (штамм 2371) был равен 0,465 ± 0,65 мм, а колоний T- того же штамма — 0,8 ± 0,12 мм.

Клон T+ на среде Серова при культивировании его в течение 1 сут при 37 °C и 2 сут при комнатной температуре формировал типичные круглые или многогранные матовые, с выпуклым центром суховатые колонии диаметром 1—2 мм. Микробные клетки Т--клона на этой среде формировали плоские блестящие влажные, часто неправильной формы колонии диаметром до 4—5 мм. Автор подчеркивает, что этот феномен не имеет отношения к R-диссоциации культур. Выявленные морфологические различия колоний зависят от различного характера упаковки микробных клеток в колонии Это было доказано при изучении поверхности T+- и Т--колоний с помощью электронного микроскопа. В центральной части Т+-колонии при увеличении 30 000 выявилась упорядоченная плотная упаковка клеток, расположенных более или менее параллельными рядами. При исследовании характера роста бактериальных клеток по краю колонии были видны клетки, плотно прижатые друг к другу, которые после деления оказывались соединенными боковыми поверхностями. Между отдельными клетками по боковой поверхности наблюдались анастомозы, не связанные с делением клеток. Бактерии T- -клонов формировали колонии, состоящие из хаотично расположенных клеток. Данный признак отчетливо выявлялся при исследовании характера роста клеток по краю колонии.

Эти исследования позволили Ф.Н. Шубину сделать заключение, что различия в формировании колоний объясняются наличием у T+-клеток способности склеиваться друг с другом после окончания процесса деления, что и обеспечивает плотную структуру колоний. Т--клетки не имеют такой способности и образуют более крупные, но менее компактные колонии. Автор отмечает, что Т--клоны были менее вирулентными, чем T+-клоны.

К этому времени появились сообщения о том, что вирулентные штаммы возбудителя псевдотуберкулеза сероварианта 3 несут плазмиду с мол. м. 45 md, названную плазмидой вирулентности. Клоны, утратившие эту плазмиду, теряют способность продуцировать V—W-антигены, вызывать кератоконъюнктивит у морских свинок и признак зависимости от Ca2+ на магниево-оксалатной среде при 37 °С. Известно, что плазмиды как носители внехромосомной генетической информации детерминируют у бактерий ряд признаков, в том числе устойчивость к антибиотикам, синтез различных антигенов, токсинов и т.д. С наличием плазмиды вирулентности у иерсиний связывают появление в бактериальной клетке специфических белков внешней мембраны с мол. м. 160—250 md, устойчивость к бактерицидному действию сыворотки, инвазивные и цитотоксические свойства бактериальных клеток. В эти же годы R.M. Zsigray и соавт. показали, что эта плазмида может интегрировать в хромосому и вновь переходить в автономное состояние.

С присутствием в штаммах иерсиний плазмиды вирулентности W.T. Chametsky и W.W. Shuford связывают способность бактерий ингибировать их фагоцитоз макрофагами и размножаться в этих клетках.

Г.П. Шведун и соавт. также выявили в штаммах псевдотуберкулезного микроба плазмиду с мол. м. 45 md. Последняя была обнаружена в отобранных на среде Хигучи—Смита Са2+-зависимых вариантах. Авторам удалось установить четкую корреляцию наличия плазмидной ДНК указанной молекулярной массы с признаком зависимости культуры от содержания Ca2+ при температуре 37 °C и вирулентностью штаммов.

С новых позиций подошла к изучению роли плазмиды вирулентности Н.Ф. Тимченко. Она показала, что существенное влияние на характер популяционных изменений бактерий псевдотуберкулеза оказывает температура их культивирования. По мере роста бактерий при температуре 37 °C на МПА в культуре увеличивается доля Ca2+-независимых клеток, которые после 15—20 пассажей составляют более 90 % популяции. При температуре 6—8 °С соотношение Са2+-зависимых и Са2+-независимых клеток не изменяется. Установлено, что кератоконъюнктивит у морских свинок вызывают только Ca2+-зависимые бактерии. В результате этих исследований было показано, что при температуре 37 °С происходят элиминация плазмиды вирулентности из бактерий и утрата ими способности вызывать кератоконъюнктивит у морских свинок и кроликов.

О резком снижении вирулентности штаммов иерсиний при потере ими плазмиды с мол. м. 45 md свидетельствуют также данные М. Mazigh и соавт. В то же время В.М. Бондаренко и Ю.Е. Полоцкий обращают внимание на тот факт, что у бактерий псевдотуберкулеза, утративших плазмиду с мол. м. 45 md, все же выявляется остаточная вирулентность. Псевдотуберкулезный микроб, утративший детерминанты вирулентности, контролируемые указанной плазмидой, способен к размножению в макрофагах. Эти же авторы полагают, что биологический смысл кальций-температурозависимого синтеза V—W-антигенов и белков наружной мембраны заключается в том, что размножающиеся в крови в присутствии достаточного количества Ca2+ при температуре 37 °С иерсинии более активно поглощаются фагоцитирующими клетками, поскольку делящиеся клетки обеднены V—W-антигенами и, по-видимому, другими белковыми антигенами наружной мембраны, синтез которых репрессируется в присутствии Ca2+ при температуре 37 °С. Это способствует дис-семинации бактерий во внутренние органы с помощью фагоцитов. Однако, попав в макрофаги, бактерии на время прекращают деление из-за дефицита в их внутриклеточной среде Cai+ и избытка Mg2+. Поэтому в это время бактерии начинают синтезировать V—W-антигены, позволяющие им противостоять переваривающей активности ферментов фагоцитов.

Установлено, что все Т+-клоны, описанные Ф.Н. Шубиным, независимо от сероварианта, территории и объекта выделения штаммов, Са2+-зависимы и содержат плазмиду с мол. м. 45 md. Т--клоны Са2+-независимы, не содержат эту плазмиду, и их вирулентность на 3 и более логарифмов ниже по сравнению с таковой Т+-клонов. Четкая корреляция морфологии колоний с Са2+-зависимостью, наличием или отсутствием данной плазмиды позволяет быстро и эффективно оценивать штаммы псевдотуберкулезного микроба и получать нужные для различных исследований клоны.

Изучение плазмидного спектра штаммов иерсиний псевдотуберкулеза показало его большое разнообразие. Несмотря на то что плазмиды являются не обязательными компонентами бактерий и могут утрачиваться как спонтанно, так и под влиянием некоторых ДНК-тропных веществ, они довольно стойко сохраняются в микробных клетках, и это позволяет использовать их в качестве маркеров при эпидемиологическом анализе заболеваемости псевдотуберкулезом.

Особый интерес представляет работа Ф.Н. Шубина и соавт., которые изучали плазмидный спектр 111 штаммов псевдотуберкулезного микроба, в том числе выделенных в населенных пунктах Чукотского автономного округа (66 штаммов), от больных людей и объектов окружающей среды во Владивостоке (18 штаммов), Ленинграде (4 штамма), Кемерове (11 штаммов) и 9 штаммов — из Института им. Л.Пастера (Париж). Выявление плазмид авторы проводили в лизатах бактерий с помощью электрофореза в агарозном геле. Молекулярную массу плазмид определяли по подвижности последних в геле в сравнении с контрольными плазмидами — PP 1 (38), P 222 (62), Tlac+ (78), Coli Е1 (42), рВР 322 (26).

В исследованиях, проведенных этими авторами, плазмиды были выявлены почти во всех свежевыделенных и музейных штаммах. Всего найдено 7 типов плазмид с мол. м. 82, 65, 45, 35, 3,5, 2,5 и 2 md. Спектр плазмид зависел от сероварианта возбудителя. Все культуры, относящиеся к серовариантам 3, 4 и 5, содержали по 1 плазмиде с мол. м. 45 md. Штаммы бактерий сероварианта 1 отличались весьма вариабельным набором плазмид. В 19 штаммах указанного сероварианта обнаружено по одной плазмиде с мол. м. 45 md. В 47 штаммах этого сероварианта обнаружено по 2 плазмиды, причем у 4 из них — с мол. м. 85 и 45 md, а у 1 — с 65 и 45 md. В 4 штаммах имелось по 3 плазмиды, в 1 из них мол. м. плазмид составляла 82, 45, 35, а у 3 — 82, 45 и 3,5 md. В 1 штамме выявлено 5 плазмид с мол. м. 82, 45, 35, 2,5 и 2 md. Изучение выявленных плазмид показало, что одна из них с мол. м. 45 md является известной плазмидой вирулентности. Она детерминирует Са2+-зависимость штаммов. Утрата этой плазмиды сопровождается стойким снижением вирулентности субклонов для белых мышей, изменением формы колоний, исчезновением признака аутоагглютинации. Это позволило Ф.Н. Шубину и соавт. прийти к заключению, что данная плазмида близка к описанной в литературе V—W-плазмиде. Особый интерес представляет плазмида с мол. м. 82 md, не обладающая температурозависимостью репликации и не элиминирующая в присутствии акридинового оранжевого. Она была обнаружена только у штаммов псевдотуберкулезного микроба, принадлежащих к сероварианту 1 — наиболее частому возбудителю заболевания. Эта плазмида выявлена авторами у всех штаммов Y. pseudotuberculosis сероварианта 1, выделенных от больных людей во время вспышек псевдотуберкулеза во Владивостоке, Ленинграде, Кемерове, Новосибирске, Южно-Сахалинске и Анадыре.

Как показали исследования Ф.Н. Шубина, способность псевдотуберкулезного микроба вызывать эпидемические вспышки инфекции среди населения связана, по-видимому, с наличием у этого микроорганизма плазмид с мол. м. 82 и 45 md, которые детерминируют особую вирулентность штаммов. Для вспышечного проявления инфекции необходимо совместное присутствие в популяции возбудителя обеих плазмид. Наличие в популяции возбудителя 1 плазмиды с мол. м. 45 md, по мнению авторов, определяет возможность лишь спорадической заболеваемости псевдотуберкулезом, т.е. проявление манифестных форм инфекции лишь у наиболее восприимчивых к псевдотуберкулезу лиц. Постановка такого вопроса, несомненно, очень интересна, однако требует дальнейших исследований.

Изучая плазмидный спектр культур псевдотуберкулезного микроба, Ф.Н. Шубин разработал необходимую для практического использования схему маркировании штаммов возбудителя псевдотуберкулеза. Все выделенные автором штаммы по содержанию в них внехромосомных генетических элементов были представлены в виде 7 плазмидных вариантов — плазмидоваров (табл. 6).

Представляют интерес материалы о генетической родственности различных штаммов псевдотуберкулезного микроба. Как показали исследования Е.I. Bottone, штаммы бактерий псевдотуберкулеза серовариантов 1—6 родственны по ДНК на 80 %. Г.Я. Ценева и соавт. в опытах внутривидовой и межвидовой гибридизации ДНК-ДНК установили высокую степень гомологии отечественных штаммов псевдотуберкулезного микроба, выделенных в разных регионах бывшего СССР и вызывающих кератоконъюнктивит у морских свинок, с эталонными культурами коллекций E.Thal и Н. Mollaret.