Температура, воздействию которой подвергаются все абиотические и биотические объекты, является одним из важнейших факторов Земли. Она, как известно, служит мерой интенсивности тепловой энергии любой системы, мерой усредненной энергии неупорядоченного движения молекул.

Температурные условия в биосфере очень разнообразны. Свыше 80 % ее принадлежит к постоянно холодным областям. Значительная часть поверхности суши и Мирового океана имеет температуру ниже 5 °С. Помимо регионов с постоянно низкой температурой, на Земле много областей с изменяющимся температурным режимом. Это прежде всего поверхностные слои морей и океанов, реки, пресные водоемы, нижняя часть атмосферы, большая часть суши в приполярных и умеренных поясах Земли. Суточные и сезонные колебания температуры могут быть в диапазоне от 0 до 30—40 °С. Везде, где преобладает низкая и непрерывно изменяющаяся температура, обитают живые организмы, адаптирующиеся к таким условиям.

Все живые организмы ранее разделяли на гомойотермные — поддерживающие температуру своего тела на постоянном уровне, и пойкилотермные — не имеющие таких возможностей и полностью зависимые от температуры окружающей среды. В настоящее время эта классификация считается устаревшей. На смену ей пришла другая, более рациональная, основой которой является источник поступления тепла в животный организм. В соответствии с этим организмы, способные продуцировать тепло внутри своего тела с помощью различных физиологических механизмов, называются эндотермными, или эндотермами, а организмы, температура тела которых полностью зависит от температуры окружающей среды, — экзотермными, или экзотермами.

Наиболее общей закономерностью воздействия температуры на скорость биохимических реакций в живом организме считается правило Арениуса, которое постулирует, что при повышении или понижении температуры среды на 10 °С интенсивность метаболизма изменяется в 2 раза (на 100 %). Следовательно, при понижении температуры среды на 10 или 20 °С интенсивность метаболизма снижается в 2 или 4 раза, что становится опасным для выживания популяции и может привести к ее гибели. Специальными исследованиями установлено, что при переходе из среды обитания с относительно высокой температурой в среду с низкой температурой экзотермные организмы способны поддерживать свой метаболизм на необходимом для жизни уровне, для чего в процессе эволюции у них сформировались специальные генетико-биохимические механизмы. Это положение четко определил Баркрофт, сказав, что «природа научилась так использовать каждую биохимическую ситуацию в организме, чтобы избегнуть тирании простого подчинения уравнению Арениуса. Она может регулировать жизненные процессы так, чтобы управлять биохимической ситуацией, а не подчиняться ей». Поддержание постоянного уровня метаболизма у экзотермных организмов при понижении температуры обитания называется температурной компенсацией (T).

Американские биохимики П. Хочачка и Д. Сомеро считают, что живые организмы имеют следующие по отношению к изменяющимся факторам окружающей среды три типа биохимической стратегии.

1. Количественная стратегия. Клетки могут постоянно содержать небольшое количество смешанного набора ферментов, включая варианты, специфически приспособленные к работе в определенных условиях. При изменении температуры клетки могут наращивать количество той группы ферментов, которая приспособлена к той или иной температуре среды.

2. Качественная стратегия. Организм может включать и выключать на генетическом уровне в соответствии с законом Жакоба и Моно синтез изоферментов, которые приспособлены к работе в тех или иных температурных условиях.

3. Конформационная стратегия. Под воздействием той или иной температуры в клетках происходят конформационные изменения третичной и четвертичной структуры ферментов, образуются так называемые мгновенные изоферменты, различные кинетические варианты молекул ферментов с одной и той же первичной структурой, благодаря чему ускоряются биохимические реакции организма.

Вопросы биохимической адаптации к обитанию в окружающей среде почти не разрабатывались в отношении патогенных микроорганизмов, поскольку считалось, что последние, будучи паразитами человека и теплокровных животных, имеют температурный оптимум 36—39 °С, т.е. являются мезофилами и не могут размножаться при низкой температуре.

Все бактериальные виды разделяются на психрофилы (диапазон роста при температуре от 0 до 20 °С), мезофилы (диапазон роста при температуре от 20 до 40 °С) и термофилы (диапазон роста при температуре от 50 до 80 °С и более). Однако это разделение относительно и имеет исключения. Проведенные нами исследования подтвердили известный факт, что псевдотуберкулезный микроб имеет психрофильные свойства и может быть отнесен к факультативным психрофилам, поскольку способен размножаться в температурном диапазоне от 0 до 45 °С.

На психрофильность псевдотуберкулезного микроба нами обращено внимание в 60-х годах при изучении ДСЛ, крупные вспышки которой отмечались в то время в Приморском крае. При этих вспышках заболевания людей, объединенных общественным питанием, развивались после употребления в пишу инфицированных псевдотуберкулезным микробом овощей, корнеплодов и молочных продуктов (творог), длительно находившихся в овощехранилищах и холодильниках. При бактериологическом исследовании этих продуктов были выделены штаммы псевдотуберкулезного микроба, идентичные штаммам, выделенным от больных людей, употреблявших эти продукты. Другой предпосылкой к изучению психрофильности псевдотуберкулезного микроба было выделение штаммов микроба из фекалий больных людей при культивировании посевов не в термостате, а в холодильнике при температуре 4—7 °С.

Следует подчеркнуть, что открытие этиологии ДСЛ было совершено благодаря использованию метода холодового обогащения посевов. Эта методика теперь определяет бактериологическую диагностику псевдотуберкулеза.

Изучение психрофильности псевдотуберкулезного микроба позволило расширить представления об экологии внеорганизменных популяций части патогенных бактерий и представить убедительные доказательства их способности размножаться в объектах окружающей среды. Это затрагивает одну из самых дискуссионных проблем эпидемиологии — представление о возможности размножения (обитания) патогенных бактерий в окружающей среде и, следовательно, признание за ней ре-зервуарной функции для некоторых возбудителей инфекционных болезней, относящихся к сапронозам и сапрозоонозам.

В этой дискуссии, продолжающейся в течение всей истории борьбы человечества с заразными болезнями, преобладала точка зрения о невозможности существования возбудителей заразных болезней в окружающей среде, что и было воплощено Л.В. Громашевским в первом законе эпидемиологии, гласящем, что источником (резервуаром) возбудителей инфекций является только зараженный человеческий или животный организм.

В 1958 г. известный микробиолог В.И. Терских выступил против такой канонизированной позиции, высказав мнение о том, что и объекты окружающей среды могут быть резервуаром для некоторых возбудителей инфекций, названных им сапронозами. Эта новая позиция в эпидемиологии подверглась тогда уничтожающей критике со стороны адептов официальной эпидемиологии, и представление о сапронозах было полностью исключено из научной и учебной литературы, а также из программ обучения по эпидемиологии, вследствие чего развитие последней в этом экологическом направлении задержалось в нашей стране на 25 лет.

Эколого-эпидемиологические исследования, проведенные в нашей стране в последние десятилетия XX в., начали расшатывать эту ортодоксальную позицию и снова привлекли внимание к вопросу о возможности существования ряда патогенных бактерий в окружающей среде.

Исследования в этом направлении начались в 60-е годы на Дальнем Востоке после открытия ДСЛ — нового для мировой науки клинико-эпидемического проявления псевдотуберкулезной инфекции у человека, которое наблюдалось в основном в виде крупных эпидемических вспышек, возникающих после употребления в пищу овощей и молочных продуктов, инфицированных псевдотуберкулезным микробом. Как уже указывалось, возбудитель этого нового клинико-эпидемического проявления псевдотуберкулеза был выделен после 5 лет неудач от больных людей при выдерживании посевов материала в холодильнике при температуре 4—7 °С, а не в термостате, как это принято в медицинской микробиологии, и не на мясопептонных средах, а в фосфатно-буферном растворе. Это позволило предположить, что низкая температура способствует размножению псевдотуберкулезного микроба в обедненной питательной среде, в которой задерживается рост других микроорганизмов. Эти необычные факты и явились предпосылкой для выдвижения и развития нового теоретического представления о психрофильности псевдотуберкулезного микроба, а затем и некоторых других бактерий, и обоснования его эколого-эпидемиологического и патогенетического значения. Дальнейшими эпидемиологическими и экспериментальными исследованиями было окончательно доказано значение этого теоретического представления. Его объективность подтверждают следующие факты:

♦ эпидемиологический анализ многих эпидемических вспышек ДСЛ позволил сделать вывод, что заболевание связано с употреблением в пищу зараженных псевдотуберкулезным микробом продуктов (овощи, корнеплоды, молоко, творог и т.д.), длительное время находившихся в овощехранилищах и холодильниках при относительно низкой температуре;

♦ инфицирование овощей и корнеплодов происходит прямо в почве или при транспортировке, переработке и хранении;

♦ псевдотуберкулезный микроб распространен в умеренных и приполярных широтах Земли, причем более высокая заболеваемость этой инфекцией наблюдается также в этих регионах и не зарегистрирована в тропическом поясе;

♦ возбудитель псевдотуберкулеза является убиквистом и широко распространен в окружающей среде. Он выделяется из почвы, пыли, воздуха, воды, овощей, фруктов, ягод и других продуктов. На Дальнем Востоке из объектов окружающей среды выделены сотни штаммов этого возбудителя и доказано, что он не только сохраняется, но и размножается в этих объектах при низкой температуре;

♦ возбудитель псевдотуберкулеза выделяется из фекалий и органов многих видов млекопитающих, птиц, земноводных, рыб и членистоногих. Выделение микроба от экзотермных животных позволяет предполагать, что он поступает к ним из окружающей среды и способен размножаться в их организме при низкой температуре;

♦ для вспышек псевдотуберкулеза характерна зимне-весенняя сезонность. Заболеваемость этой инфекцией находится в обратной зависимости от сезонного хода температуры воздуха, т.е. с повышением температуры воздуха заболеваемость снижается, с понижением — возрастает;

♦ выделенные из почвы, воды и овощей штаммы обладают относительно высокой вирулентностью. При низкой температуре микроб не только размножается в этих объектах, но и сохраняет, а при благоприятных условиях даже повышает свою вирулентность;

♦ основными свойствами бактерий псевдотуберкулеза, которые усиливаются при низкой температуре среды обитания и реализуются на этапе инициации инфекционного процесса, являются подвижность, хемотаксис, высокая адгезивность, инвазивность и токсичность;

♦ выращенные при низкой температуре бактерии псевдотуберкулеза в эксперименте на животных в пределах 10—15 мин проникают через эпителий и ткани слизистых оболочек в кровь и органы, сразу определяя развитие генерализованного инфекционного процесса;

♦ при пониженной температуре культивирования псевдотуберкулезный микроб интенсивнее продуцирует различные токсины, которые при попадании в макроорганизм уже в первые часы вызывают развитие патологических проявлений в органах животных;

♦ псевдотуберкулезный микроб при низкой температуре роста длительно (более 3,5 лет) сохраняет плазмиду вирулентности (мол. м. 45—48 md) и способность к реализации детерминируемых ею свойств. При температуре 37 °С бактерии утрачивают эту плазмиду и после 15—20 пассажей их популяции более чем на 90 % состоят из клеток, лишенных ее;

♦ при низкой температуре популяция микроба поддерживает свою вирулентность на относительно высоком уровне. При повышении температуры до 37 °C происходит снижение вирулентности популяции. В течение первых дней роста вирулентность снижается в 30—60 раз вследствие подавления экспрессии хромосомных генов, детерминирующих тканевую инвазивность, а в дальнейшем, когда бактерии утрачивают плазмиду рYv, их вирулентность уменьшается еще в 1000 раз.

Все изложенное позволяет утверждать, что низкая температура среды играет существенную роль в экологии псевдотуберкулезного микроба и эпидемиологии вызываемой им инфекционной болезни и способствует развитию эпидемического процесса. Несмотря на многочисленные публикации о полученных нами результатах, официальная эпидемиология сначала не признавала выдвигаемых нами представлений и дискуссия о возможности размножения патогенных бактерий в окружающей среде продолжалась. Для доказательства правомочности новых представлений необходимо было найти ключи, которые бы открыли новое видение этого вопроса, т.е. надо было выявить генетикобиохимические механизмы, обеспечивающие возможность размножения патогенных бактерий в объектах окружающей среды при ее низкой и непрерывно изменяющейся температуре. Если такие механизмы имеются, то все становится на свое место, поскольку природе незачем было бы создавать специальные гене-тико-биохимические системы безо всякой на то необходимости.

Вопреки традиционному изучению ферментов патогенных бактерий при температуре 37—38 °С, нами проводились исследования ферментов при низкой температуре (4—6 °С). Культуры бактерий выращивались при температуре 37 °С и 4—6 °С. Сравнительная оценка их ферментативной активности осуществлялась также при этих температурах. Исследования, проведенные с помощью колоночной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном и крахмальном гелях, показали, что у ферментов псевдотуберкулезного микроба и некоторых других возбудителей сапронозов имеется несколько вариантов изоферментов, одни из которых функционируют при высоких, а другие при низких температурах. При этом их ферментативная активность при низкой температуре была более высокой. Следовательно, у изучаемых видов бактерий различные температуры индуцируют изоферменты, способные проявлять свою активность при разных температурах, в результате чего и поддерживается необходимый для жизни уровень обмена при изменении температуры окружающей их среды. Как выяснилось позднее, американские биохимики П.Хочачка и Д.Сомеро (1988) выявили подобные температурозависимые изоферменты у разных видов рыб и морских беспозвоночных животных, назвав их «Холодовыми» и «тепловыми» изоферментами. Полученные факты еще раз свидетельствуют о большой общности генетико-биохимических механизмов в живой природе и позволяют утверждать, что обнаруженная закономерность есть только одно из проявлений адаптационной стратегии эктотермных организмов к изменению температурных условий обитания.

При изучении психрофильности патогенных бактерий у нас сложилось предположение о разном характере метаболизма у бактерий при высокой и низкой температуре. Известно, что бактерии-сапрофиты обладают очень большой адаптивной изменчивостью, позволяющей им обитать в непрерывно изменяющихся условиях окружающей их среды. Большинство из них являются миксотрофами, т.е. способны переходить от гетеротрофного к автотрофному типу питания или использовать оба типа одновременно в зависимости от наличия в их окружении органических и неорганических соединений. Перед нами встал вопрос, не могут ли и патогенные бактерии, относящиеся к факультативным паразитам (возбудители сапрозоонозов), также быть миксотрофами? Можно предположить, что псевдотуберкулезный микроб при обитании в почве в условиях дефицита углерода способен поглощать углекислый газ из газовоздушной смеси почвенных камер, содержащих в десятки раз большее его количество, чем атмосфера воздуха.

Веским подтверждением неприхотливости псевдотуберкулезного микроба к питанию является его способность активно размножаться в речной и водопроводной воде. Высказываются предположения, что размножение микроба в воде, кроме возможности ассимиляции газов воздуха, может обеспечиваться за счет автолиза погибших клеток и использования для его питания выделившихся из них органических и неорганических соединений (при выщелачивании солей из стеклянной посуды, применяемой в опытах; при использовании для приготовления синтетических сред солей, загрязненных посторонними веществами, содержащими азот и углерод; при предварительном накоплении в клетках резервных питательных веществ — р-оксимасляной кислоты, полисахаридов, полифосфатов, которые могут длительно поглощаться клетками при плохих трофических условиях, как это отмечается у бактерий сапрофитов с олиготрофным типом питания). Установлено, что размножение псевдотуберкулезного микроба в воде и синтетических минеральных средах, не содержащих соединений углерода и азота, идет за счет поглощения последних из воздуха и ассимиляции органических и неорганических соединений, выделившихся в среду при гибели и автолизе бактериальных клеток. В одном из экспериментов по изучению размножения Y. pseudotuberculosis во взвесях убитых бактерий псевдотуберкулеза он размножался значительно активнее при концентрации мертвых клеток в 10в9, чем при 10в3 в 1 мл.

Влияние выщелачивания стеклянной посуды и загрязненности применяемых солей на размножение псевдотуберкулезного микроба было исключено.

Псевдотуберкулезный микроб может размножаться на синтетических минеральных средах, не содержащих углерода и азота. Л.М. Классовский и соавт. на основании исследований по изучению питания псевдотуберкулезного микроба предположили, что этот микроорганизм при нахождении в окружающей среде главную часть своих потребностей в азоте и углероде покрывает за счет содержащихся в атмосфере молекулярного азота и углекислого газа. Авторы предполагали, что псевдотуберкулезный микроб обладает олигонитрофильными и олигокарбофильными свойствами, и это сближает его с почвенными микроорганизмами. В комплексной работе, проведенной с сотрудниками Института микробиологии РАН Д.И. Никитиным и О.И. Слабовой, было подтверждено, что углекислый газ поглощается растущей культурой псевдотуберкулезного микроба. В дальнейших исследованиях при помощи радиоизотопного метода было показано, что меченый углерод (14C) двуокиси углерода встраивается во все основные биополимеры бактериальной клетки (белки, углеводы, липиды, ДНК и РНК). Следует отметить, что поглощение газов происходит при низкой температуре более интенсивно. Характер использования бактериями газовых субстратов при низкой температуре, вероятно, является отражением их способности обитать в относительно «голодных» условиях почвы и воды при характерной для них низкой температуре. Все это позволяет высказать мнение, что псевдотуберкулезный микроб может быть отнесен к факультативным автотрофам, олиготрофам и водородным бактериям. Он также является миксотрофом, поскольку способен переходить от хемоор-ганогетеротрофного типа питания при нахождении в теплокровном организме к хемолитоавтотрофному — при обитании в окружающей среде. Эти свойства и обеспечивают ему высокую экологическую пластичность, его двойственную (сапрофитную и паразитическую) природу.

Поскольку и некоторые другие возбудители сапрозоонозов (кишечные иерсинии, листерии, эризипелотрикс и др.) способны размножаться при низкой температуре, полученные материалы позволили нам обосновать теоретическое представление о психрофильности патогенных бактерий и ее эколого-эпидемиологическом и патогенетическом значении. Первое заключается в признании того, что возбудители некоторых сапрозоонозов, в частности псевдотуберкулезный микроб, способны длительно размножаться в окружающей среде с ее относительно низкой и непрерывно меняющейся температурой, в результате чего они могут накапливаться в ее объектах и сохранять, а при благоприятных условиях и повышать свою вирулентность, что и определяет возможность формирования эпидемически значимых популяций, инициирующих возникновение эпидемического процесса. Второе значение состоит в том, что у патогенных бактерий при низкой температуре формируется флагеллярный аппарат, появляются активная подвижность и хемотаксис, повышаются адгезивные и инвазивные свойства, возрастает антифагоцитарная активность и повышается токсигенность. Все это определяет инициацию механизмов патогенеза и возможность развития инфекционного процесса у людей и животных.

Представленные материалы свидетельствуют об огромных адаптационных способностях псевдотуберкулезного микроба, относящегося к факультативным паразитам, способного существовать в таких столь различных экологических условиях, как окружающая среда и внутренняя среда теплокровного организма. Чрезвычайно широкая изменчивость биологических свойств псевдотуберкулезного микроба служит адаптационным фенотипическим проявлением заложенных в геноме программ, значительно превышающих современные представления о его возможностях.

В связи со способностью размножаться при различных температурах и в различных местах обитания иерсинии выработали два механизма, контролирующих экспрессию генов, кодирующих факторы патогенности. Один механизм реагирует на изменение температуры окружающей среды, другой на концентрацию Ca2+.

Вирулентные штаммы иерсиний содержат гомологичную плазмиду с мол. м. от 42 до 50 md, которая кодирует синтез большого количества белков, сообщающих иерсиниям вирулентные свойства и называемых Yops-белками. Синтез Yops-белков in vitro координированно регулируется температурой и концентрацией Ca2+ в культуральной среде. Максимальная экспрессия и секреция достигаются при температуре 37 “С в среде, лишенной Ca2+, т.е. в условиях, аналогичных внутриклеточной среде обитания бактерий. Добавление в среду Ca2+ при 37 °С репрессирует транскрипцию Yop-генов благодаря репрессору LcrH, кодируемому геном IcrH. Мутации в гене IcrH депрессируют экспрессию Yop в присутствии Ca2+. Предполагается, что белок YopN воспринимает изменения концентрации Ca2+ в среде и переводит воспринятый сигнал внутрь клетки.

Белок VirF (LcrF), принадлежащий к семейству AraC транскрипционных регуляторов, активизирует транскрипцию Yop-генов в ответ на изменение температуры от 26 до 37 °С.

Таким образом, по данным А.Л. Гинцбурга и Ю.М. Романовой, две регуляторные системы контролируют экспрессию Yop-генов: одна осуществляет позитивный контроль в ответ на изменения температуры, а другая — негативный в ответ на изменение концентрации Ca2+.

Взаимодействие или координация этих двух регуляторных механизмов позволяет иерсиниям очень рационально расходовать свои энергетические ресурсы в ходе инфекционного процесса. Попадая внутрь фагоцитирующей клетки периферической крови в структуру фагосомы, содержащую сыворотку крови, богатую Ca2+, иерсинии активно размножаются. По мере понижения концентрации Ca2+ прекращается размножение микроба, и его трансляционный аппарат переключается на наработку факторов патогенности.

Сущность проблемы экологии и эпидемиологии сапронозов и сапрозоонозов сводится к решению вопросов: где, когда и при каких условиях у находящихся в окружающей среде популяций патогенных бактерий формируется высокая вирулентность, определяющая возможность возникновения эпидемического процесса и, следовательно, заболеваемости в человеческом обществе. Проведенные экологические исследования только наметили пути к решению этих кардинальных вопросов. Решение их в полном объеме позволит коренным образом улучшить систему профилактики некоторых инфекционных болезней, относящихся к сапронозам и сапрозоонозам. Опыт борьбы с псевдотуберкулезом, основанный на выдвинутых теоретических представлениях, полностью оправдал себя и внедрен в практику здравоохранения.