Исследуя микрофлору человека, апробируя медицинские препараты и биодобавки к пищевым продуктам, содержащим лактобациллы, следует учитывать, что Lactobacillus spp. обладают различной по силе и спектру воздействия антагонистической активностью. Наиболее подробно изучено влияние продуктов, выделяемых лактобациллами, на рост условно-патогенных бактерий и грибов рода Candida. Эксперименты такого рода могут осуществляться в жидкой среде или при использовании двухслойных или однослойных плотных питательных сред. В различных лабораториях задействованы неодинаковые методы оценки антагонистической активности микробов. Существенно отличаются и критерии оценки полученных результатов. Чаще всего о степени антагонистической активности бактерий (не учитывая микробицидный эффект) судят по величине зоны задержки роста индикаторных микробов. Значительно реже оценивается максимальное количество индикаторных бактерий, на которые Lactobacillus spp. оказывают ингибирующее действие.

Данные, полученные различными авторами при изучении микробного антагонизма, не однозначны и трудно сопоставимы. Одним из существенных недостатков большинства исследований является невозможность проведения эспериментов с широким кругом микробов, отличающихся по метаболическим потребностям, а также отсутствие четких количественных показателей антагонистической активности с учетом возможного микробиостатического и микробицидного воздействия.

В своей работе авторы исследовали антагонистическую активность лактобацилл в зависимости от их количества. Использованные питательные среды: MPCl и МРС4 (Институт вакцин и сывороток (ИВС), Санкт-Петербург, Россия), триптозный агар («Бегах», Германия), мясо-пептонный бульон (МПБ) (Научно-производственное объединение, г. Махачкала, Россия). Штаммы микроорганизмов, использованных в данной работе: L. plantarum 8Р-АЗ (лактобактерин, НПО «Биомед», Россия), L. reuteri («Пробиотика» Швеция), L. casei DN-114001 defensis (йогурт «Актимель», Россия), Candia albicans ATCC 885-653, Staphylococcus aureus ATCC 25 923, Escherichia coli ATCC 25 922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25 853. Лактобациллы выращивали на среде MPCl в течение 48 ч. Другие бактерии культивировали 18—24 ч на МПБ. Культуры Lactobacillus spp. хранили в обезжиренном молоке при -20 °С. В течение 48 ч С. albicans культивировали на среде Сабуро. Хранение грибов и индикаторных бактерий осуществляли в триптозном агаре под маслом.

Антагонистическую активность лактобацилл исследовали методом двухслойного агара. Принципиальное отличие в нашем подходе заключалось в жестком количественном контроле содержания лактобацилл в нижнем слое агара, используя серию разведений последних и одну и ту же засевную дозу для всех индикаторных микробов. Сравнительный анализ антагонистической активности лактобацилл проводили, предложив специальный показатель — МИК (минимальное количество лактобацилл, ингибирующее рост тест-культуры), выраженный в Ig КОЕ/мл среды. Микробиостатическое или микробицидное действие лактобацилл выявляли методом отпечатков. Используя метод отпечатков, удалось показать, что при отсутствии признаков роста микробов на поверхности двухслойного агара, содержащего лактобациллы, бактерии в большинстве случаев теряли свою жизнеспособность. Грибы лишь на время утрачивали способность к размножению при указанных значениях МИК. Фунгицидный эффект оказывали L. plantarum 8А-РЗ, засеянные в концентрациях в 10—100 раз больших, чем минимальная ингибирующая рост грибов величина. Наличие бактериоцидного или фунгицидного эффекта устанавливали, если через 48 ч инкубации проб следов роста микробов обнаружить не удавалось.

Как известно, антагонистическая активность лактобацилл в организме человека может быть обусловлена многими факторами: конкуренцией за рецепторы, действием бактериоцинов и бактериоциноподобных веществ, молочной и уксусной кислот, перекиси водорода. В наших исследованиях учитывался суммарный эффект продуктов, выделяющихся лактобациллами, который легче всего оценить в предварительных испытаниях in vitro, когда микробы не находятся в тесном контакте друг с другом. В работе был использован метод двухслойного агара, имеющий ряд преимуществ перед другими способами изучения антагонизма микробов. Во-первых, засевая лактобациллы в толщу агара и помещая сверху дополнительный слой плотной среды, создаются близкие к анаэробным условия культивирования лактобацилл, при которых, как было показано ранее, их антагонистическая активность проявляется в большей мере. Использование двухслойного агара позволяет осуществлять подсев индикаторных культур уже через 2 и 24 ч после начала инкубации Lactobacillus spp. При исследовании антагонизма лактобацилл на плотной однослойной среде индикаторные микробы рекомендуется подсевать через 48—96 ч. Во-вторых, преимуществом является возможность культивирования индикаторных культур с различными типами метаболизма. В наших экспериментах были созданы условия для изучения антагонистических свойств лактобацилл по отношению к грибам рода Candida, стафилококкам и эшерихиям, с широким диапазоном приспособляемости к различным условиям культивирования, а также к псевдомонадам, не растущим на среде МРС.

Сравнивая МИК трех штаммов Lactobacillus spp., обнаружены как общие свойства, так и индивидуальные черты, характерные для отдельных штаммов. Все исследованные штаммы лактобацилл оказывали ингибирующее действие на грибы в значительно большей концентрации (в 100—1000 раз) по сравнению с индикаторными бактериями. Это подтверждают данные, документированные ранее многими авторами. Благодаря использованию метода отпечатков, в данной работе выявлен не только фунгистатический эффект действия Lactobacillus spp., описанный ранее, но и фунгицидный. Доказано, что конечный эффект связан с количеством и временем предварительной инкубации лактобацилл до подсева грибов.

Следует подчеркнуть, что все использованные в настоящей работе Lactobacillus spp. проявляли выраженный бактерицидный эффект в отношении псевдомонад. В то же время ряд авторов отмечают наличие устойчивых или мало чувствительных к действию лактобацилл Pseudomonas spp. Результаты, полученные при изучении влияния Lactobacillus spp. на жизнеспособность стафилококков и эшерихий, представляют особый интерес, так как демонстрируют возможность наряду с общими свойствами, характерными для большинства лактобацилл, выявлять индивидуальные характеристики этих бактерий. Нельзя исключить, что данные, полученные при исследовании L. reuteri, могут быть обусловлены способностью лактобацилл этого вида вырабатывать реутерин и реутероциклин, избирательно ингибирующие рост только грамположительных (Гр+) микробов и не оказывающие подобного действия на грамотрицательные (Гр-) микробы, в частности Е. coli. Анализ антагонистической активности к нескольким микробам показал, что максимальное действие in vitro оказывал штамм культуры L. plantarum, несколько меньший эффект проявили штаммы L. reuteri и L. casei.

Таким образом, нами показано, что использование нового показателя (МИК), определяющегося при исследовании антагонистической активности методом серийных разведений лактобацилл в двухслойном агаре, может быть приоритетным для первоначального скрининга антагонистических свойств лактобацилл и, очевидно, других микробов при изменении условий культивирования и питательных сред.