Помимо влияния на фертильность, выявление ГВ в эякуляте ставит перед исследователями ряд других вопросов: как вирус попадает в эякулят; может ли он находиться внутри мужских гамет; возможно ли оплодотворение яйцеклетки инфицированным сперматозоидом; как влияет ГВИ мужских гамет на течение беременности. Обсуждению перечисленных проблем посвящен данный подраздел.

Внутригаметная герпесвирусная инфекция. Известно, что ВПГ и ЦМВ передаются половым путем и могут реплицироваться в эпителиальных клетках урогенитального тракта. Кроме того, ВПГ и ЦМВ обнаружены в эпидидимисе, простате, семенных пузырьках — органах, принимающих участие в формировании семенной жидкости. Репликация ГВ в указанных органах может быть источником накопления вирусов в эяуляте, в составе внеклеточной фракции.

Возможность внутригаметной ГВИ остается предметом научной полемики. В нескольких независимых исследованиях показано, что инкубация сперматозоидов человека с ВПГ и ЦМВ in vitro не приводит к проникновению вируса в клетку. Однако в последнее время накапливаются данные о выявлении маркеров ГВ в мужских гаметах ex vivo. В сперматозоидах из эякулята обследованных мужчин выявляют ДНК ВПГ и ЦМВ методом ПЦР, ПЦР in situ, ДНК-гибридизации in situ. Есть сообщения об обнаружении в сперматозоидах антигенов ГВ, а также инфекционной активности ВПГ и ЦМВ. Методом электронной микроскопии в цитоплазматической капле сперматозоидов обнаружены вирусоподобные частицы, морфологически идентичные нуклеокапсидам ГВ.

Для разрешения указанного противоречия была предложена гипотеза, согласно которой ГВ попадают в гаметы на этапе пролиферации и дифференцировки половых клеток в яичке. Действительно, в ряде работ описывают выявление в мужских гонадах маркеров ВПГ и ЦМВ, однако мнения исследователей относительно клеток-мишеней вирусов расходятся. В некоторых работах показано присутствие ГВ в клетках герминативного эпителия — сперматоцитах, сперматидах, сперматозоидах. Другие авторы указывают на то, что источником репликации ГВ в яичке служат соматические клетки; Лейдига, перитубулярные и эндотелиальные клетки интерстиция.

С целью изучения взаимодействия ГВ с мужскими половыми клетками разработана модель ВПГ- и ЦМВ-инфекции яичка in vitro, позволяющая изучать инфекционный процесс на протяжении 16 дней. Иммуногистохимическая окраска препаратов органной культуры яичка, зараженной ВПГ, позволила выявить вирусные антигены в клетках Лейдига, перитубулярных клетках и ранних сперматидах на 4-й день после инфицирования. На 8-й день культивирования инфицированными оказались также сперматогонии и сперматоциты, к 14-му дню после заражения были выявлены единичные сперматозоиды, содержащие антигены ВПГ.

При изучении ЦМВИ яичек на первой неделе культивирования вирусные антигены выявляли в фибробластах, перитубулярных клетках и единичных сперматидах. На 8-й день в культуре были выявлены инфицированные сперматогонии и сперматоциты, а к 16-му дню — единичные сперматозоиды, содержащие антигены ЦМВ (рис. 15).

Полученные результаты были подтверждены при ультраструктурном исследовании зараженных фрагментов. На первой неделе инфекции вирусные частицы с характерной для Herpesviridae морфологией выявляли в клетках интерстиция, сперматогониях, сперматоцитах, сперматидах. При этом выявляли как полноценные вирионы, содержащие капсиды типа С, так и большое количество дефектных вирусных частиц — капсиды типа А и В, плотные тельца (рис. 16).

Отсутствие вируса в зрелых половых клетках на ранних сроках культивирования подтверждает данные об их невосприимчивости к ГВ. Исключительно важным представляется выявление ВПГ и ЦМВ в сперматозоидах на поздних сроках инфекции. У человека для образования сперматозоидов из ранних сперматид требуется около 2 нед. Наличие маркеров вируса в сперматидах с 4-го дня инфекции позволяет предположить, что инфицированные клетки продолжают спермиогенез, что к 16-му дню приводит к формированию сперматозоидов, содержащих вирус. Следует отметить, что количество вирусных частиц в клетках интерстиция значительно превышает вирусную нагрузку в половых клетках. Возможно, относительно низкий уровень репликации ГВ в герминативных клетках позволяет им завершить последующие этапы сперматогенеза.

Изучение взаимодействия вируса с мужскими половыми клетками позволяет не только исследовать патогенетические механизмы, лежащие в основе нарушения фертильности у мужчин с ГВИ сперматозоидов, но и разработать рекомендации по лечению таких пациентов. Поскольку сперматогонии — стволовые клетки сперматогенеза — являются чувствительными к ВПГ, полную элиминацию вируса из эякулята следует ожидать через 74—76 дней после окончания курса противовирусной терапии — время, необходимое для созревания сперматозоидов из потенциально инфицированного сперматогония.

Выявление герпесвирусов в подвижных сперматозоидах. Выявление ГВ в мужских гаметах ставит вопрос о роли сперматозоидов в вертикальной передаче инфекции. Возможность внутригаметной инфекции описана для целого ряда других вирусов: ВПЧ, ВГВ, ВГС, ВИЧ. Особую актуальность проблема вирусной контаминации сперматозоидов обрела с развитием ВРТ: экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), инъекции сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки (ИКСИ), инсеминация донорской спермой. Для очистки мужских гамет от инфекционных агентов из эякулята выделяют и отмывают фракцию подвижных сперматозоидов. В связи с этим представляется актуальной задача изучения вирусных маркеров в отмытых сперматозоидах подвижной фракции — клетках, которые в подавляющем большинстве случаев имеют нормальную морфологию и могут участвовать в оплодотворении.

В проведенном исследовании показано присутствие во фракции подвижных сперматозоидов как вирусной ДНК, так и инфекционной активности ВПГ и ЦМВ. Для изучения эффективности отмывки ГВ проводили сравнение вирусной нагрузки в цельном эякуляте и в соответствующей фракции подвижных сперматозоидов. Снижение вирусной нагрузки после отмывки отмечали только в 50 % ВПГ-положительных и в 70 % ЦМВ-положительных образцов. Низкая эффективность отмывки в элиминации ГВ свидетельствует о том, что используемые методы не обеспечивают отбраковку инфицированных гамет. Использование ПЦР in situ позволяет визуализировать вирусную ДНК в мужских гаметах в виде метки и оценить количество сперматозоидов, пораженных вирусом (рис. 17). Доля ВПГ-инфицированных сперматозоидов в образцах составляла от 0,5 до 3,2 % (в среднем 1,5 %) от общего числа гамет. В пробах, содержащих ЦМВ, пораженными оказались от 0,25 до 15 % (в среднем 1 %) сперматозоидов. Как следует из полученных результатов, большая часть подвижных сперматозоидов в инфицированном эякуляте свободна от вируса. По всей видимости, вероятность оплодотворения яйцеклетки инфицированным сперматозоидом, которую можно соотнести с долей зараженных гамет, в среднем составляет 1-1,5 %.

Следует отметить, что выявляли ГВ в подвижных сперматозоидах как у пациентов с нарушением фертильности, так и у здоровых мужчин, в том числе доноров спермы. На присутствие ГВ в образцах донорской спермы указывают и другие исследователи.

В свете накопленных данных о внутригаметной локализации ГВ, ухудшение функциональных и морфологических характеристик сперматозоидов представляется механизмом естественного отбора, не позволяющим инфицированному сперматозоиду оплодотворить яйцеклетку. Выявление ГВ в подвижных сперматозоидах ставит под сомнение эффективность указанного защитного механизма. Является ли сохранение нормальных функциональных и морфологических характеристик инфицированных гамет достаточным для оплодотворения или вертикальной передаче вируса препятствуют иные селективные механизмы — этот вопрос остается открытым.

Возможность оплодотворения яйцеклетки инфицированным сперматозоидом. Один из подходов к исследованию указанной проблемы состоит в разработке животных моделей инфицирования яйцеклетки при оплодотворении. P. A. Neighbour при инкубации ооцитов и сперматозоидов с мышиным ЦМВ in vitro наблюдали присутствие неинфекционных вирусных частиц в перивителиновом пространстве. Учитывая, что zona pellucida защищает ооцит от проникновения вирусов, авторы предположили, что вирус проникает в яйцеклетку вместе со сперматозоидом. Показана контаминация эмбрионов коровы, полученных in vitro, ГВ коров и вирусом диареи коров при использовании инфицированных сперматозоидов.

При использовании другого способа заражения — микроинъекции ДНК мышиного ЦМВ в мужской пронуклеус зиготы мыши — J. F. Baskar и соавт. наблюдали уменьшение размеров плаценты, а также задержку и аномалии развития плода. Наличие ДНК мышиного ЦМВ в тканях плода было показано методом ПЦР и ДНК-гибридизации. Заражение эмбриона при инъекции вирусной ДНК в мужской пронуклеус имеет важное клиническое значение, так как указывает на возможность заражения яйцеклетки при проведении ИКСИ.

Другие авторы при инъекции мышиного ЦМВ в мужской пронуклеус зиготы мышей выявляли вирусную ДНК до формирования бластоцисты у 56 % эмбрионов, однако при формировании плода ДНК исчезала, заражение вирусом не влияло на выживаемость эмбрионов и не вызывало признаков ЦМВ-инфекции у потомства.

Другой подход к изучению возможности вертикальной передачи ГВ связан с вирусологическим исследованием эякулята мужчин, жены которых страдают привычным невынашиванием беременности, то есть имеют в анамнезе два и более самопроизвольных аборта при 

естественном оплодотворении или использовании вспомогательных репродуктивных технологий. Известно, что спонтанное прерывание беременности является одним из осложнений ВПГ-инфекции и ЦМВ-инфекции. Установление корреляции между присутствием ГВ в эякуляте мужчин и эпизодами невынашивания беременности у их жен может служить косвенным подтверждением возможности вертикальной передачи ГВ.

В препаратах, полученных из эмбрионального материала после спонтанных абортов, ВПГ выявляли в 59 % случаев, в то время как инфицирование матерей составляло 20 %, что позволяет предположить: не только женский, но и мужской фактор вносит вклад в спонтанное прерывание беременности. Описано выделение идентичного типа ВПГ в эякуляте отцов и в абортивном материале при повторяющихся спонтанных абортах.

F. A. Uzal, исследуя вспышку спонтанных абортов в нескольких стадах коз (100 абортов из 300 беременностей) и одновременно язвенные поститы у самцов, выявили ВПГ в тканях плода и антитела к вирусу герпеса у самцов.

Проведено обследование мужчин, жены которых обращались по поводу невынашивания беременности. В подвижных сперматозоидах выявили инфекционно активный ВПГ в 18 % случаев, вирусную ДНК — у 21 % мужчин. ДНК ЦМВ у данных пациентов встречалась в 11,1 % случаев, инфекционно активный ЦМВ в подвижных сперматозоидах не был обнаружен. При этом не было выявлено различий в частоте обнаружения вирусных маркеров у мужчин, жены которых страдали повторными спонтанными абортами, по сравнению с мужчинами контрольной группы. Несколько независимых исследований подтверждают отсутствие зависимости между ВПГ- и ЦМВ-инфицированием сперматозоидов и эффективностью результатов естественного оплодотворения и ЭКО.

В то же время ряд авторов указывают на наличие связи между ГВИ гамет и спонтанным прерыванием беременности. При помощи НРИФ выявлены аденовирусы и ВПГ в эякуляте мужчин, являющихся партнерами женщин с повторяющимися абортами. ВПГ и аденовирус также были выделены в культуре клеток из эякулята 40 % таких пациентов. В группе пациентов, у жен которых в анамнезе отмечали спонтанное прерывание беременности при помощи НРИФ и (или) БКМ, инфицирование сперматозоидов ВПГ выявлено у 29 из 36 (81 %) пациентов. При электронно-микроскопическом исследовании в сперматозоидах пациентов этой группы в 68 % случаев выявлены капсиды, идентичные ГВ. В группе сравнения доля мужчин с инфицированными сперматозоидами оказалась меньше и составила 55 % (р < 0,05); вирусные капсиды в сперматозоидах этих пациентов не обнаружены. Таким образом, несмотря на отсутствие единого мнения в вопросе о риске оплодотворения яйцеклетки инфицированным сперматозоидом, большинство авторов указывают на существование такой возможности.

В заключение отметим, что данные о ГВИ внутри гамет и подвижных сперматозоидов предполагают участие мужского фактора в вертикальной передаче инфекции. Указанная гипотеза находит подтверждение как при экспериментальном моделировании на животных, так и при изучении корреляции между ГВИ сперматозоидов и спонтанными абортами в браке.

Рекомендации национальных андрологических сообществ отражают озабоченность специалистов проблемой вертикальной передачи ГВ с эякулятом. Так, во Франции недавно перенесенная первичная ЦМВ-инфекция является критерием отбраковки доноров спермы. Американское общество андрологов рекомендует исследовать всех кандидатов на донорство на наличие антител к ЦМВ и использовать сперму серопозитивных доноров только для оплодотворения серопозитивных пациентов. Британские андрологи предъявляют более строгие требования к отбору потенциальных доноров спермы — отсутствие антител к ЦМВ является обязательным условием для участия в программе инсеминации. При этом проводят 6-месячную карантинизацию эякулята, позволяющую выявить сероконверсию у доноров, не имеющих антител к ЦМВ на момент обследования.

Существующие рекомендации, направленные на снижение риска вертикальной передачи ГВ со сперматозоидами, базируются на серологическом статусе обследуемых мужчин. Однако ряд исследований свидетельствует об отсутствии строгой зависимости между серологическим статусом пациента и выявлением вируса в эякуляте. Так, при отсутствии ЦМВ в эякуляте в сыворотке обследованных мужчин обнаружены антитела класса IgG — в 34,5 %, IgM — в 0,7 % случаев. И, наоборот, у мужчин, в эякуляте которых обнаружен вирус, IgG выявлен лишь в 50 % случаев, IgM не выявлен в крови ни одного из пациентов. На наш взгляд, для предотвращения вертикальной передачи ГВ при использовании BPT или при естественном планировании беременности необходима разработка алгоритма диагностики ГВИ гамет с использованием нескольких методов выявления вирусов в эякуляте (БКМ, ПЦР).