Как указывалось ранее, к настоящему времени наиболее изучены антигены меланомы. В ходе изложения предыдущего материала о раково-тестикулярных антигенах отмечено, что по частоте экспрессии указанных антигенов и генов, которые их кодируют, меланома занимает ведущее место. Так, частота экспрессии генов MAGE, BAGE, GAGE и NY-ESO-1 клетками меланомы достаточно высока и как минимум один из них экспрессируется не менее чем в 50 % случаев меланом. Однако наряду с этими антигенами клетки меланомы, а также нормальные меланоциты экспрессируют антигены, известные как тканеспецифические дифференцировочные антигены меланоцитов. Антигены данной группы также представляют собой продукты немутантных генов, и к ним относятся: gp100 (Рmеll7), тирозиназа, TRP-l/gp75, TRP-2, MART-1/Melan-A, р-15. Начиная со средины 90-х годов XX ст. дифференцировочные антигены меланомы становятся предметом интенсивного изучения различными группами исследователей в разных странах мира.

Одним из первых антигенов этой группы был описан гликопротеин gp100, который экспрессировался не только клетками меланомы, но и нормальными меланоцитами, а также клетками радужной оболочки глаза. Идентифицирован ген, кодирующий этот антиген, и установлено, что он распознается ЦТЛ, инфильтрирующими меланому, лимфоцитами периферической крови и представляется молекулами HLA-A2.1. Проведенные исследования позволили выделить эпитоп этого антигена — gp100 (280—288), который распознается ЦТЛ. Авторы приведенных данных показали также, что одновременное введение gp100 в сочетании с IL-2 вызывает регрессию метастазов у аутологичных больных, что сразу же предопределило возможность его использования для иммунотерапии.

Иммунотерапевтический потенциал этого антигена был подтвержден новыми данными, из которых следовало, что белок gp100 распознается не только CD8+-, но СD4+Т-лимфоцитами. Презентация gp100 СD4+Т-лимфоцитов рестриктирована HLA-DR53 и DQw6 аллелями; предметом распознавания в этом случае является эпитоп — gp100 (175—189), а также два других эпитопа — gp100 (74—89) и gp100 (556—590), которые рестриктированы другими молекулами ГКГ — HLA-DR7. Тот факт, что экспрессия данных эпитопов наблюдается в клетках меланомы у значительного количества больных, существенно расширил возможности использования их в иммунотерапии.

Эффективность использования белка gp100 для иммунотерапии нуждается и в четком определении соответствующих критериев для gp100-вакцинации. В этом плане очень важен анализ результатов эффективности вакцинации большого количества больных меланомой. Оказалось, что при вакцинации белком gp100 больных, опухолевые клетки которых не экспрессировали этот антиген меланомы, значительно возрастает количество метастазов — факт, наглядно иллюстрирующий необходимость владения информацией об особенностях экспрессии антигенов опухоли до начала вакцинации.

Тирозиназа — внутриклеточный фермент — тканеспецифический дифференцировочный антиген клеток меланомы и меланоцитов. На первых этапах изучения тирозиназы было показано, что этот антиген распознается ЦТЛ и представляется молекулами I класса ГКГ: HLA-A2, HLA-A24 и HLA-В44. Однако впоследствии установили, что тирозиназа, подобно белку gp100, может индуцировать не только активность ЦТЛ, но и СD4+T-лимфоцитов. Было выделено два пептида — Iy 56—70 и Ту 448—462, каждый из которых обладал способностью взаимодействовать с молекулами как I, так и II класса ГКГ. При этом авторы отмечали различия в аффинитете связывания указанных пептидов с молекулами ГКГ — интенсивность аффинитета Ту56—70-взаимодействия средняя, Ту448—462 — слабая; презентация указанных пептидов осуществляется молекулами HLA-DRB1*0401. Удалось выделить пептид тирозиназы YMDGTMSQV, который презентируется молекулами НLА-А*0201. После иммунизации рекомбинантной вакциной было установлено, что рестриктированная цитотоксичность ЦТЛ индуцируется в ответ на пептид FMDGTMSQV у трансгенных мышей, которым была произведена трансфекция гена тирозиназы.

По мнению авторов, тирозиназа может быть использована как модель для изучения антимеланомных вакцин, которые могут генерировать мультивалентный иммунологический ответ.

TRP-1 (tyrosinase related protein 1, или gp75) подобно другим антигенам меланомы экспрессируется как клетками меланомы, так и меланоцитами, а также клетками радужной оболочки глаза; идентифицирован ген, кодирующий этот антиген. TRP-1 презентируется молекулами HLA-А3.1 (исследовались лимфоциты, инфильтрирующие меланому). Эксперименты с кДНК показали, что белок gp75 кодируется геном, который экспрессируется только клетками меланомы, нормальными меланоцитами и может быть мишенью для специфической иммунотерапии меланомы. Так же, как белок gp100 и тирозиназа, этот антиген может индуцировать гуморальный и клеточный ответ и поэтому перспективен для использования в специфической иммунотерапии меланом. В этой связи представляют интерес данные о том, что иммунитет к gp75/TRP-l сопровождается снижением регуляции на уровне IFNy и этим отличается от другого тканеспецифического антигена меланомы TRP-2.

TRP-2 (tyrosinase related protein 2) экспрессируется клетками меланомы, меланоцитами, а также клетками радужной оболочки глаза. TRP-2 был идентифицирован как второй антиген меланомы, который представляется молекулами HLA-А3.1 и подобно другим антигенам меланомы экспрессируется только клетками меланомы, меланоцитами, клетками радужной оболочки глаза и не экспрессируется другими клетками. Из TRP-2 выделен пептид LLPGGRPYR, который распознается ЦТЛ и в определенной концентрации способен сенсибилизировать клетки-мишени для лизиса ЦТЛ. Эффективность применения антигена TRP-2 для вакцинации подтверждается экспериментальными исследованиями, из которых следует, что у мышей после иммунизации белками gp100 и TRP-2 наблюдается очень высокий уровень регрессии меланомы.

MART-1/Melan-A экспрессируется нормальными меланоцитами и большинством клеток меланом. У человека этот антиген распознается преимущественно рецептором Т-лимфоцитов — TCRa. Лимфоциты периферической крови и инфильтрирующие меланому распознают MART-1, в частности его эпитоп 27—35 (AAGIGILTV), который рассматривается как иммунодоминантный пептид. Частота лизиса клеток, экспрессирующих этот пептид и HLA-A*0201, доходит до 50 %. Указанный эпитоп может подвергаться мимикрии, в соответствии с чем модулируется ответ ЦТЛ на MART-1 (27—35).

Дальнейшие исследования этого эпитопа показали, что существует его аналог ELAGIGILTV, который также представляется молекулами HLA-A2 и обладает способностью индуцировать высокий уровень антигенспецифического ответа Т-лимфоцитов. Доказательство существования различных эпитопов MART-1 предполагает возможность оптимизации Т-клеточного ответа с учетом выбора того пептида, который оказывает наиболее выраженное действие.

Выделение цитотоксических Т-лимфоцитов из меланомы показало, что такие лимфоциты, инфильтрирующие опухоль больных меланомой, распознают преимущественно пептиды меланомоассоциированных антигенов, в частности MART-1 (пептид 27—35) и gp100 (пептид 280—288); распознавание указанных пептидов осуществлялось в отношении HLA-А2-положительных опухолевых клеток.

Наряду с бесспорной возможностью использования MART-1 для иммунотерапии анализ достоверности частоты экспрессии этого антигена дает основание рекомендовать его для раннего выявления микрометастазов в сторожевых лимфатических узлах при меланоме кожи, в этом он имеет несомненные преимущества по сравнению с такими маркерами, как белки S-100 и НМВ-45.

В настоящее время получены синтетические конъюгаты MART-1/Melan-A, обладающие высокой иммуногенностью и высокой резистентностью к действию пептидаз. Такие конъюгаты рассматриваются как новая генерация потенциальных иммуногенов, которые могут использоваться для получения антимеланомных вакцин.

К сожалению, клетки меланомы могут продуцировать белковые факторы, снижающие экспрессию антигена MART-1/Melan-A, в результате чего он становится “молчащим”. Отсутствие экспрессии антигенов в этих случаях может быть обратимо удалением супернатанов опухолевых клеток, которые экспрессируют MART-1/Melan-A. Приведенные данные свидетельствуют о наличии аутокринного пути подавления экспрессии антигенов и служат новым объяснением возможности прогрессии роста меланомы in vivo в присутствии специфических ЦТЛ Констатация способности клеток меланомы продуцировать такие факторы крайне важна при решении вопроса о проведении иммунотерапии. He исключено также существование факторов, которые могут снижать экспрессию и других антигенов меланомы.

Начавшееся клиническое использование антигенов меланомы в целях иммунотерапии рака с контролем цитотоксической активности лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, и периферической крови привело к интересным наблюдениям. Во-первых, было показано, что после иммунизации с использованием белка gplOO, MART-1/Melan-A и тирозиназы происходила резкая регрессия опухоли, а ЦТЛ опухоли распознавали эпитопы этих антигенов, которые были рестриктированы HLA-A2. Во-вторых, при исследовании цитотоксичности лимфоцитов периферической крови выявлено, что они имеют высокий уровень цитотоксичности и против тех антигенов, которые не использовались для иммунизации — NY-ESO-1 и TRP-2. Эти данные привели к заключению, что NY-ESO-1 и TRP-2 могут играть важную роль в деструкции опухоли обследованных больных.

Современные методические возможности позволяют значительно расширить частоту выявления дифференцировочных антигенов меланомы, в частности MART-1 и gp100, что иллюстрирует использование метода лазерной сканирующей цитометрии.

Подытоживая данные изучения различных антигенов меланомы следует отметить, что они имеют различную иммуногенность в системах in vivo и in vitro, а MART-1/Melan-A по сравнению с другими антигенами меланомы наиболее часто распознается как in vivo, так и in vitro.

На основании изучения антигенов меланомы появилась возможность оценить полученные данные с позиций их клинического значения.

1. Гены gp100 и TRP-2 чаще всего экспрессируются клетками опухолей тех больных, у которых в момент обследования имело место либо обострение заболевания, либо метастазирование.

2. Частая экспрессия генов gp100, MART-1 и тирозиназы отмечена в клетках метастазирующей меланомы с различиями в уровнях их экспрессии у отдельных больных. При этом есть основания констатировать возможность дифференцированного распознавания антигенов различными субпопуляциями ЦТЛ: часть ЦТЛ распознают одни антигены, а часть — другие.

3. MART-1/Melan-A имеет высокую диагностическую ценность для выявления микрометастазов в лимфатические узлы при меланоме кожи. Наряду с этим выявлено, что при развитии меланом других локализаций, в частности слизистой оболочки рта и синонозальных полостей, практически все синонозальные меланомы экспрессируют тирозиназу и MART-1/Melan-А (соответственно 100 и 95 %), в то время как для десмопластических опухолей слизистой оболочки его экспрессия не характерна.

4. Одна из важных особенностей антигенов меланомы состоит в том, что практически все они распознаются не только CDS+-, но и СD4+Т-лимфоцитами, что существенно расширяет возможности использования их в иммунотерапии.

Многие дифференцировочные антигены меланомы уже применяются не только для экспериментальной иммунотерапии, но и в клинике. Опыт их клинического использования свидетельствует, что по полученным результатам пока сложно оценить терапевтическую эффективность, однако это не снижает значимости предполагаемого иммунотерапевтического потенциала антигенов меланомы, а лишь фиксирует внимание на необходимости длительного клинического испытания с обязательным иммунологическим контролем в процессе терапии. В этой связи заслуживают внимания данные об использовании дендритных клеток, нагруженных различными антигенами меланомы. Согласно этим данным, терапевтическая эффективность такой иммунизации в сочетании с должным уровнем иммунологического ответа наблюдается при использовании дендритных клеток, нагруженных несколькими антигенами меланомы, в частности MART-1/MelanA, тирозиназой, MAGE-3 и gp100. Наконец, очень объективной представляется оценка G. Parmi-ani, который на основании анализа большого клинического материала считает, что, во-первых, при вакцинации MART-1/Melan-А не обнаружено корреляции между Т-клеточным ответом лимфоцитов больных на этот антиген и клинической эффективностью, во-вторых, отмечает, что только у ограниченного числа больных с распространенной меланомой развивается специфический иммунологический ответ, который, однако, не способен эффективно прерывать метастазирование.

В общей оценке использования перечисленных антигенов — продуктов немутантных генов, представляет интерес точка зрения о том, что такие антигены, как BAGE, GAGE, NY-ESO-1, MART-1, gp100 потенциально способны вызывать иммунологический ответ. Развитию ответа может препятствовать стабильность их структуры, поэтому уменьшение стабильности, например расщепление, весьма существенно при их использовании с терапевтической целью.

Как известно, простата относится к тем немногим органам, клетки которых имеют тканеспецифичекие антигены. Один из наиболее изученых антигенов простаты — тканеспецифический PSA (prostate specific antigene). Указанный антиген представляет собой гликозилированную хемотрипсино подобную сириновую протеазу и обнаруживается как в клетках ткани простаты, так и в семенной жидкости. В настоящее время в сыворотке крови PSA определяется в 5 изоформах, которые, в свою очередь, имеют различные конфигурации. Отдельные изоформы PSA отличаются как содержанием сиаловых кислот, так и особенностями организации их наружных цепей. Специфический антиген простаты может находиться и в свободной (PSA), и в связанной (CPSA — complexed prostate specific antigene) формах.

Особое значение приобретает определение PSA с целью диагностики рака простаты, а также дифференциальной диагностики ее злокачественных и доброкачественных опухолей, что подтверждается значительным количеством исследований. Заключение, которое следует из этих работ, свидетельствует о том, что PSA — наиболее надежный маркер из общего числа опухолевых маркеров. В исследованиях последних лет на основании изучения соотношения CPSA и общего PSA (TPSA — total prostate specific antigene) показано, что это соотношение при раке простаты изменяется и особенно достоверно содержание TPSA, что может иметь существенное значение для диагностики рака простаты.

Наряду с высоким диагностическим значением определения PSA5 в частности находящегося в сыворотке, установлена высокая корреляция между уровнем сывороточного PSA и степенью гистологических изменений.

Подобно другим антигенам опухолевой клетки PSA может быть как предметом распознавания, так и мишенью для иммунотерапии. При распознавании, в частности дендритными клетками, одни изоформы PSA взаимодействуют с маннозо-рецептором, а другие — с Fc-фрагментом. Исследование этих вариантов взаимодействия показало, что PSA, который связывается с маннозо-рецептором, оптимально презентируется молекулами II класса ГКГ, a PSA, взаимодействующий с Fc-фрагментом, способен презентироваться молекулами как I, так и II класса.

Эпитопы PSA распознаются ЦТЛ здоровых лиц и больных раком простаты. Получен синтетический эпитоп PSA-146-154, который представляется молекулами HLA-A2 и индуцирует цитотоксичность Т-лимфоцитов здоровых лиц при условии экспрессии этими клетками HLA-A2. Индукция ЦТЛ под влиянием указанного пептида наблюдалась и при исследовании in vitro Т-клеточного ответа больных раком простаты, рефрактерных к гормонотерапии. Стимулированные таким образом Т-лимфоциты продуцировали IL-4. Возможность активации Т-клеток показана и при исследовании другого эпитопа — PSA-3А, который усиливает связывание с молекулами HLA-А2 и повышает стабильность комплекса пептид-молекулы ГКГ. Эффект усиления Т-клеточного ответа наблюдается при иммунизации дендритными клетками, нагруженными PSA-3А-пептидом; такие клетки продуцируют большое количество IFNγ.

Способность PSA распознаваться Т-лимфоцитами обосновывает перспективы его применения для иммунотерапии. В настоящее время имеются сообщения о результатах такой вакцинотерапии с использованием различных эпитопов PSA, дендритных клеток и др. Полученные данные дают основание для разработки подходов к эффективной иммунотерапии с использованием PSA при раке простаты и проведения клинических испытаний.

Как следует из представленных данных, тканеспецифические дифференцировочные антигены, которые также являются продуктами нормальных генов, могут распознаваться лимфоцитами. Многие из антигенов этой группы способны распознаваться различными субпопуляциями Т-лимфоцитов, что значительно расширяет возможный спектр их использования для иммунотерапии.