До 60-х годов XX столетия бактериологический метод диагностики известных тогда форм псевдотуберкулеза был малоэффективен и позволял подтвердить клинический диагноз лишь в 10—12 % случаев. Использование комплекса методов исследований — серологических, бактериологического, патологоанатомического, аллергологического — позволило значительно увеличить этот показатель. Однако раскрытие истинной природы заболевания даже при таком широком комплексном подходе было затруднено. Объясняется это следующим: в исследуемом материале (фекалии), взятом от больного псевдотуберкулезом, находится обычно весьма незначительное количество иерсиний и в то же время огромное число микроорганизмов, относящихся к нормальной микрофлоре кишечника человека, что очень мешает выделению чистой культуры псевдотуберкулезного микроба. Эти обстоятельства, а также отсутствие в прежнее время дифференциально-диагностических питательных сред для выделения возбудителя псевдотуберкулеза являлись причиной малоэффективных результатов бактериологического исследования.

В 1963 г. J.S.Paterson и R.A.Cook для выделения псевдотуберкулезного микроба из фекалий грызунов стали применять метод холодового обогащения — фосфатно-буферный раствор с инкубацией посевов не при температуре 37 °С, а при 4 °С. Приведенные в главе 2 сведения о биологических свойствах псевдотуберкулезного микроба свидетельствуют о целесообразности такого подхода, так как в его основе лежит способность иерсиний хорошо размножаться на «голодных» средах при низкой температуре, в то время как другие микроорганизмы в этих условиях не способны расти или растут очень слабо.

Создание Г.Д. Серовым специальной дифференциально-диагностической среды № 67 стало важным этапом в разработке системы бактериологической диагностики псевдотуберкулеза. В состав этой среды входят индикатор конго красный, глюкоза, мочевина, молибденовокислый аммоний, генциановый фиолетовый, сухая желчь, гидрокарбонат натрия и питательный агар. Среди этих ингредиентов автор выделяет три группы: индикаторную (конго красный, глюкоза и мочевина), ингибиторную (генциановый фиолетовый и желчь) и группу питательных веществ и стимуляторов роста (питательный агар, глюкоза и молибденовокислый аммоний). Вещества индикаторной группы придают колониям псевдотуберкулезного микроба очень характерный вид, ингибиторные — тормозят рост сопутствующей микрофлоры, питательные вещества и стимуляторы роста способствуют более быстрому формированию колоний иерсиний. Характер роста возбудителя псевдотуберкулеза на этой среде представлен в табл. 21.

Большим преимуществом среды № 67 перед другими плотными питательными средами является то, что колонии псевдотуберкулезного микроба, вырастающие на ней, можно легко отличить от колоний микроорганизмов других видов, имеющих на этой среде иной вид.

Больные псевдотуберкулезом выделяют бактерии с испражнениями, реже — с мочой, еще реже — со слизью из зева. В испражнениях возбудитель псевдотуберкулеза обнаруживается на протяжении всей болезни и в период рецидивов. В отдельных случаях он может выделяться до 1,5 мес.

Диагноз псевдотуберкулеза подтверждается выделением возбудителя у 26—70 % больных при групповых и у 10—15 % — при спорадических заболеваниях.

Основным материалом для бактериологического исследования служат фекалии и в меньшей степени смывы из зева, моча и аппендикулярные отростки, удаляемые при хирургическом вмешательстве. По эпидемиологическим показаниям бактериологическому исследованию подлежат фекалии домашних животных, органы и фекалии грызунов и рыб, смывы с овощей, фруктов, других продуктов и с поверхностей оборудования и инвентаря пищеблоков, а также вода. Сбор материала от больных производится в следующие сроки: смывы из зева — в 1-й день болезни; исследования мочи — в течение 1-й недели, фекалий — на протяжении всего периода болезни, в начале реконвалесценции, а также во время рецидивов. Высеваемость иерсиний наиболее высока на 1-й неделе.

Смывы из зева берут утром до приема пищи стерильным тампоном, смоченным изотоническим раствором хлорида натрия Мочу в количестве 20—30 мл собирают в стерильную посуду. Фекалии собирают стерильной деревянной или картонной лопаткой в количестве 2—3 г также в стерильную посуду. Первый сбор фекалий необходимо проводить до начала лечения антибиотиками. Смывы с овощей, корнеплодов и других продуктов берут тампоном в пробирку с 7—10 мл фосфатно-буферного раствора. Смывы следует брать с поверхности влажных или портящихся клубней картофеля, свеклы, моркови, с корней и мокнущих головок репчатого лука, загнивающих листьев кочанной капусты. Одним тампоном следует смачивать 2—5 экземпляров овощей и корнеплодов, ополаскивая его после обработки каждого экземпляра в пробирке со средой. При исследовании квашеных овощей тампон смачивают в рассоле в разных местах бочки или делают смывы с ее стенок ближе к уровню рассола. При взятии смывов с оборудования и инвентаря протирают тампоном 100 см2 площади. Буферный раствор при взятии смывов является одновременно консервантом и средой накопления для последующих бактериологического и серологического (реакция торможения непрямой гемагглютинации — РТНГА) исследований.

Кроме рекомендованных сред, псевдотуберкулезный микроб можно выделять на обычном мясопептонном агаре (МПА) с генциановым фиолетовым и кровью, средах Эндо, Левина, Морисса, модифицированной среде Морисса с кристаллическим фиолетовым и микостатином, средах Лейфсона, Мак-Конки, Книшли и др. В наших исследованиях использовались только среды Эндо и Левина, поэтому мы не можем судить об эффективности других сред. Вероятно, некоторые из них представляют интерес для бактериологической диагностики псевдотуберкулеза, но высокоэффективные среды, сконструированные на Дальнем Востоке, не вызывали у нас необходимости в проведении подобных сравнительных исследований, тем более что по данным литературы было ясно, что все другие среды не имели каких-то особых преимуществ в выделении чистых культур иерсиний псевдотуберкулеза.

Отсев подозрительных колоний с твердой питательной среды проводят одновременно на скошенный МПА и на скошенный столбик одной из дифференциальных сред, содержащих мочевину, — на среду Олькеницкого, универсальный скошенный столбик Серова, среду Лурье, модифицированную Любаревым. Посев на скошенный столбик производят по его поверхности и уколом в столбик. Культуру на скошенном столбике с мочевиной инкубируют при 37 °С, на скошенном МПА — при комнатной температуре. На средах с мочевиной возбудитель псевдотуберкулеза растет в виде матового сухого налета на скошенной поверхности и дает рост в направлении укола по всей высоте столбика. При этом в результате разложения мочевины и образования щелочи среды Олькеницкого и универсальный скошенный столбик через 1 сут приобретают малиновый цвет, а среда Любарева — краснооранжевый.

Дальнейшую идентификацию выделенного штамма проводят со скошенного агара. Ферментативная активность исследуется обычным способом на средах Гисса с набором углеводов и спиртов. Определяются ферментация глюкозы, лактозы, мальтозы, маннита, сахарозы, сорбита, арабинозы, рамнозы, рафинозы, мелибиозы, выявляется наличие орнитиндекарбоксилазы, фенилаланиндезаминазы, образование индола, сероводорода, ацетилметилкарбинола (реакция Фогеса — Проскауэра), рост на цитратной среде Симонса, подвижность.

Определение серологической принадлежности выделенных культур вначале проводят ориентировочно путем PA на стекле с типоспецифическими сыворотками к серовариантам 1—8 псевдотуберкулезного микроба в разведении 1 : 25. Для окончательного решения вопроса о серологической принадлежности штамма ставят развернутую PA в пробирках с разведением сыворотки до ее титра.

Бактериологическое исследование материала обычным способом предполагает длительное (до 28 дней) инкубирование его в среде накопления при 4—6 °С с периодическими высевами на твердую питательную среду. Описанная методика имеет существенный недостаток — медленное накопление бактерий псевдотуберкулеза в условиях выращивания при пониженной температуре и как следствие — длительность бактериологического исследования. Поэтому позже был предложен ускоренный метод бактериологической диагностики псевдотуберкулеза, который основан на использовании более высокой температуры (+29 °С) инкубирования посевного материала в среде накопления, что ускоряет размножение возбудителя. Отрицательные последствия размножения посторонней микрофлоры снимаются обработкой материала 0,5 % раствором едкого кали перед высевом его на дифференциальную среду. Следует отметить, что в качестве среды накопления предпочтительно пользоваться фосфатно-буферным раствором. Неприхотливость псевдотуберкулезного микроба к питательным средам создает ему некоторые преимущества роста по сравнению с другими видами бактерий. Применение этого метода не исключает необходимости исследования материала прямым посевом. При ускоренном методе материал засевают одновременно в 2 пробирки со средой накопления: одна из них инкубируется при температуре 29 °С, а вторая — при 4—6 °С; из первой пробирки через 48 ч инкубации делают высев на дифференциальные среды с применением щелочной обработки посевного материала. Данная обработка основана на относительной резистентности иерсиний псевдотуберкулеза к 0,5 % раствору едкого кали по сравнению с другими энтеробактериями.

Для проведения высева при использовании «щелочного» метода предварительно готовят 40 % раствор едкого кали в стерильном флаконе на стерильной дистиллированной воде, раствор можно хранить при температуре 4 °С длительное время (до появления осадка). Перед посевом из 40 % раствора едкого кали готовят его 0,5 % раствор на стерильном 0,5 % растворе хлорида натрия. Для этого в отдельную стерильную пробирку вносят 7,9 мл 0,5 % раствора хлорида натрия и добавляют 0,1 мл 40 % раствора едкого кали. Приготовленный таким образом раствор щелочи разливают по 0,2 мл в лунки полистироловой пластины. После этого в лунку вносят большую (диаметром 4 мм) петлю исследуемого материала со среды обогащения (0,04 мл). Смесь тщательно перемешивают, выдерживают в течение 1 мин и этой же петлей делают посев на чашку с дифференциальной питательной средой. Дальнейшее исследование посевов ведут по обычной методике. При посеве материала, обработанного щелочью, Y. pseudotuberculosis растут, как правило, в виде чистой или почти чистой культуры. Если при этом возбудитель изолировать не удалось, исследование продолжают из пробирки, находящейся в холодильнике, и далее по общепринятой схеме. Отработанные пластины дезинфицируют, замачивая их в 1,5 % растворе хлорамина на 2—3 ч, после чего тщательно моют и высушивают. Перед очередным использованием пластины заливают до краев 96 % этиловым спиртом, выдерживают 1,5—2 ч, спирт сливают, пластины высушивают и используют в работе.