Антигены этой группы, в отличие от описанных ранее, представляют собой качественно новые структуры опухолевой клетки и поэтому рассматриваются как истинные опухолеспецифические антигены. Еще в начале 90-х годов было отмечено, что появление опухолеспецифических мутантных белков может быть связано с точечными мутациями, транслокациями в хромосомах, делециями и мутагенезом, обусловленным вирусами. В результате синтезируются новые структуры с измененной аминокислотной последовательностью.

Хорошо известно, что злокачественная трансформация клетки во многих случаях сопровождается изменениями на уровне генома, что влияет на рост, дифференцировку и многие другие свойства опухолевых клеток. Однако изменения в геноме опухолевой клетки далеко не всегда сопровождаются, во-первых, появлением новых продуктов таких измененных генов, а во-вторых, возможностью их выявления, что связано с общими трудностями выделения опухолевых антигенов, а соответственно и продуктов мутантных генов. Это делает понятным, почему в настоящее время количество идентифицированных опухолевых антигенов, появляющихся в результате мутаций, невелико.

Начиная со средины 90-х годов, по мере накопления соответствующих данных некоторые авторы начинают анализировать состояние вопроса о мутантных антигенах. К сожалению, таких данных немного. Большой вклад как в изучение антигенов — продуктов мутантных генов, так и в анализ состояния этого вопроса внесли Н. Schreider и сотрудники. Суммируя известные к настоящему времени сведения, можно констатировать, что указанные антигены имеют ряд отличий от антигенов — продуктов нормальных генов.

Прежде всего следует указать, что белки — продукты мутантных генов — обладают выраженной способностью связываться с молекулами ГКГ, образуя соответствующие комплексы, которые распознаются лимфоцитами. Белки, образовавшиеся в результате повреждения генов, индуцируют высокую специфичность иммунологического ответа, опосредованную Т-лимфоцитами, что достоверно показано в сингенных системах. Изоляция и изучение особенностей таких антигенов, выделенных из опухолей человека и мышей, показывают, что пептиды, появившиеся в результате соматических мутаций, являются истинно специфическими.

Одна из важных особенностей опухолеспецифических антигенов — продуктов мутантных генов — состоит в том, что они сохраняют свою специфичность в течение опухолевого процесса, что позволяет рассматривать их как стабильные специфические мишени не только для различных иммунотерапевтических воздействий, но, возможно, и других. Доказательства такой стабильности получены в опытах на мышах, у которых с помощью ультрафиолетовых лучей были индуцированы злокачественные опухоли кожи. Из таких опухолей удалось выделить два опухолеспецифических антигена, которые представляют собой рибосомальные белки, появившиеся в результате точечных мутаций в соответствующих генах, что сопровождалось снижением уровня нормальных аллелей; оба антигена кодировались различными генами и распознавались CD4 Т-лимфоцитами.

Идентификация и выделение опухолеспецифических антигенов в настоящее время проводится с использованием двух подходов. Первый — сиквенс ДНК известных мутатных генов с последующей характеристикой соответствующих белков и их использованием для индукции специфического Т-клеточного ответа. Второй — индукция активности Т-клеток под влиянием иммунизации цельными опухолевыми клетками. Несмотря на то, что оба подхода дают возможность генерировать специфический Т-клеточный ответ, авторы проведенного анализа полагают, что антигены, полученные с использованием указанных выше подходов могут иметь различия. Например, продукты мутантных антигенов — иммунорецессивные, а опухолевые клетки, имеющие такой антиген, сами по себе не способны индуцировать ответ CD8+T-лимфоцитов. В отличие от этого эпитопы, распознающиеся CD8+Т-лимфоцитами, но идентифицированные с помощью другого подхода, индуцируют лизис опухолевых клеток и большинство из них, если не все, иммунодоминантны. Причины таких различий, несомненно, вызывают интерес, и, по мнению Н. Schreiber и сотрудников (авторы не исключают также возможность других объяснений), это вызвано тем, что иммунорецессивные антигены опухолевой клетки продуцируются в очень малых количествах. К настоящему времени известны такие антигены этой группы. Mut. MUM-1, Mut.cDK-4, Mut.p-катенин, Mut.p16, pRB, CASP-8, α-актенин-4, продукт мутации гена TGFβRII, Mut.L9, Mut.p53.

При общем сравнительно небольшом количестве идентифицированных опухолевых антигенов — продуктов мутантных генов не все из них изучены в равной мере. Наиболее изучены Mut.cDK-4 и Mut.MUM-1, α-катенин, продукты мутантного гена k-ras; имеется достаточно информации и о продуктах мутантного гена р53, который индуцирует иммунологический ответ, а также продуктах ряда мутантных генов, в частности EGP и IIR TGFβ. В последние годы появляется информация и о новых мутантных антигенах.

Мутантный белок cDK-4 (cyclin dependent kinase 4). Известно, что cDK — один из семи ингибиторов CD44/6. Наличие cDK защищает от связывания с D-циклинами, а прогрессия опухолевого процесса ассоциируется с активацией cDK, что показано при исследовании клеток различных опухолей. Возникновение мутаций на уровне генов, контролирующих циклиновые киназы, в частности CDK-4, лишает их способности выполнять свою физиологическую роль, однако изменение антигенной структуры превращает их в мишень для распознавания ЦТЛ.

Мутантный белок cDK-4 впервые был выявлен на клетках меланомы и идентифицирован как опухолеспецифический антиген, который распознается ЦТЛ в комплексе с молекулами HLA-A2. Мутантные аллели cDK-4 выявлены в культуре аутологичных клеток меланомы, а мутации соответствующего гена обнаружены по аргенинцистеиновым остаткам; именно участки этих пептидов распознавались ЦТЛ и препятствовали связыванию cDK-4 ингибитора pl61NK4a. Авторы полагают, что указанные мутации cDK-4 могут способствовать появлению опухолеспецифического антигена и прерывать регуляцию клеточного цикла, влияя на супрессор опухолевой прогрессии pl6lNK4a.

MUM1 (multiple myeloma oncogene 1, или interferon regulatory factor 4) был идентифицирован как онкоген, экспрессия которого связана с хромосомной транслокацией в клетках множественной миеломы; в последующем было установлено, что MUM1 представляет собой регуляторную молекулу и включается в дифференцировку В-клеток и онкогенез. В настоящее время установлено, что белок MUM1 экспрессируется клетками многих лимфопролиферативных опухолей, злокачественных меланом, но отсутствует в клетках других опухолей человека. Предполагается, что экспрессия гена MUM1 зависит от стадии дифференцировки злокачественных В-клеток и, вероятно, его определение может быть использовано для констатации злокачественности В-клеточной пролиферации. Параллельное исследование пептидов MUM1, MAGE-3 и тирозиназы показало, что MUM1 имеет аналогичный аффинитет связывания с молекулами HLA~B*4402 и HLA- В*4403, что свидетельствует о его связывании с молекулами I класса ГКГ.

Продукт мутации гена TGFβRII. Мутации на уровне гена, кодирующего RII TGFβ, обнаружены практически во всех случаях наследственного рака прямой кишки и лишь в 15 % спорадического рака этой локализации. Такие мутации приводят к появлению новых последовательностей в С-терминальной части белка. Наличие опухолеспецифического антигена было выявлено в результате распознавания ЦТЛ нового эпитопа — RLSSCVPVA, который представляется молекулами HLA-А*0201. Клоны Т-лимфоцитов были получены в результате активации HLA-A2-положительных ЦТЛ здоровых лиц с последующей повторной активацией этих клеток дендритными клетками, нагруженными указанным эпитопом. Из общего количества клеток, активированных таким образом, был выделен один клон ЦТЛ, способный лизировать HLA-А2+-клетки линии рака прямой кишки, имеющих мутантный ген TGFβRII. Авторы считают, что выделенный эпитоп может быть компонентом вакцины для иммунотерапии некоторых видов карцином.

Мутантный белок р53. Мутации гена, контролирующего синтез белка р53 — основного регулятора клеточного цикла, наблюдаются при многих опухолях. В 1997 г. были открыты два гена р53 — р53 и р73, каждый из которых кодирует отдельные изоформы белка р53. Предполагается, что взаимодействие между членами семейства р53 может приводить к мутации гена р53 и усилению туморогенеза. Большинство изменений в гене, кодирующем белок р53, имеет характер мутаций и выявляется с высокой частотой (от 60 до 70 %) при раке кишечника, желудка, легкого, пищевода, а также раке молочной железы и опухолях мозга — соответственно от 20 до 70 %. Большинство мутаций наблюдается при высокодифференцированных опухолях, что сочетается с плохой выживаемостью. Во многих случаях мутантный белок р53 накапливается в клетках, что сопровождается появлением высокоспецифичных антител против этого белка; уровень циркулирующего мутантного белка р53, который обладает выраженной иммуногенностью, повышается по мере прогрессии и инвазии опухоли, а высокий уровень анти-р53-антител сочетается с плохим прогнозом, например, при раке желудка. Наличие антител против мутантного белка р53 свидетельствует, что он относится к антигенам, которые представляются антигенпрезентирующими клетками СD4+Т-лимфоцитам.

Мутантный белок L9. Одним из первых антигенов — продуктов мутантных генов был идентифицирован рибосомальный белок L9 из клеток опухоли мышей (6132А), индуцированных ультрафиолетовым облучением. Из лимфоцитов таких мышей были изолированы клоны СD4+Т-лимфоцитов, которые распознавали клетки указанной опухоли, а некоторые из этих клонов ингибировали ее рост. Отмечено, что аминокислотная последовательность белка L9 отличается от строения аналогичного нормального белка изменениями в одном участке, что вызвано мутациями гена, кодирующего гистидин. Весьма важно подчеркнуть, что полученные на основе мутантного белка L9 синтетические аналоги оказались на 1000 порядков активнее в индукции активности Т-клеток по сравнению с обычным пептидом, что свидетельствует об исключительных свойствах этого белка.

Альфа-актинин-4 (α-actinin-4) — мутантный антиген, который кодируется геном α-актинин-4, выделен из ЦТЛ, инфильтрирующих первичную крупноклеточную карциному легких человека. Указанный белок является результатом точечных мутаций и представляется молекулами HLA-A2. Чрезвычайно интересно, что при исследовании большого количества больных опухолевые клетки с наличием такого антигена были выделены только у одного из них, что свидетельствует об уникальности данного случая. Несмотря на то, что такой антиген выделен только у одного больного, этот случай заслуживает внимания, так как после удаления опухоли больной не получал какой-либо терапии и в течение длительного периода наблюдения находился в состоянии ремиссии. Авторы предполагают, что наличие указанного мутантного антигена индуцирует высокую ЦТЛ-специфическую активность лимфоцитов, что и обеспечило длительную ремиссию.

Продолжив эти исследования, авторы выделили у этого же больного два клона ЦТЛ: один — из лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, другой — из периферической крови. Клон клеток, изолированных из периферической крови, отличался низкой способностью к распознаванию и лизису специфических мишеней. Выяснилось, что α-актинин-4-реактивные клоны лимфоцитов различной локализации используют и различные цепи TCR, так как только клон лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль и экспрессирующих TCRβ, отличался высокой функциональной активностью, в то время как ЦТЛ с низкой активностью выявлялись исключительно в периферической крови. Результаты этих исследований представляют интерес в связи с тем, что TCR в лимфоцитах периферической крови и инфильтрирующих опухоль имеют различный репертуар рецепторов и лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, отличаются экспансией ЦТЛ с высокой противоопухолевой активностью.

Белок ретинобластомы — pRB (retinoblastoma protein) представляет собой продукт изменений в гене, принадлежащем к RB-зависимому семейству. Экспрессия этого белка резко повышается в большинстве клеток эпителиальных опухолей человека (более 80 % железисто-эндометриальных клеток были положительны). Экспрессия pRB выявлена также на клетках многих сарком мягких тканей, в одних случаях этот белок — продукт гена ретинобластомы, а в других — гена MTSl/cDKN2; в последнем случае он экспрессируется агрессивными мезенхимальными опухолями. Появление мутаций или других изменений на уровне гена в клетках мягкотканных сарком приводит к нарушению контроля клеточного цикла и является плохим прогностическим признаком. Появление белка pRB в большинстве случаев обусловлено мутациями в соответствующем гене. Однако в связи с тем, что мутационные изменения наблюдаются не во всех случаях, предполагается, что экспрессия pRB может быть обусловлена и другими изменениями гена.

Бета-катенин (β-catenin) играет центральную роль во внутриклеточной адгезии, активирует транскрипцию в Wnt-сигнальном пути; контроль функционирования β-катенина осуществляется также геном опухолевой супрессии, уменьшающим его количество. Усиление его экспрессии отмечено при многих опухолях: карциноме почек, раке желудка и др. Увеличение количества β-катенина в некоторых опухолях, например при раке почки, связано с гистологической формой, а при раке простаты он формирует фенотип резистентности опухоли к терапии. Во многих случаях экспрессия β-катенина сочетается с экспрессией Е-катхерина. Нередко β-катенин, в частности при нелеченных формах рака простаты, экспрессируется с Е-катхерином. Экспрессия этих белков была повышена в клетках первичных опухолей и снижена в метастазирующих. Такие закономерности экспрессии данных белков привели к заключению, что снижение регуляции на их уровне формирует метастатический потенциал. Даже этого, далеко не полного перечня возможных аспектов участия β-катенина и комплекса β-катенин — Е-катхерин в опухолевом процессе достаточно для утверждения об их важной роли в регуляции, хотя многое в этом вопросе еще остается неясным.

При исследовании гена, контролирующего β-катенин, показано, что частота его мутаций незначительна, однако параллельно наблюдаются мутации и на уровне супрессорного гена.

Изменения на уровне генома приводят к транскрипционным или посттранскрипционным повреждениям комплекса β-катенин — Е-катхерин, что сопровождается нарушением не только адгезии, но и трансдукции сигнала к ядру и цитоскелету.

Из лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль меланомы, выделен специфический клон ЦТЛ. которые распознают β-катенин; последний представляется молекулами HLA-A24. Структурный анализ распознаваемого пептида показал, что мутационные изменения наблюдаются в сериновом и фенилаланиновом остатках (позиция 27); в клетках нормальных тканей этого же больного такие мутационные повреждения не обнаружены. В дальнейших исследованиях был выделен пептид SYLDSGIHF, который связывается с HLA-A24.

Предполагается, что генетические дефекты, приводящие к увеличению количества β-катенина, могут способствовать прогрессии меланомы.

Продукт мутации гена рецептора vIII EGF (EGFRvIII — epidermal growth factor receptor) появляется в результате делеции в его экстрацеллюлярном домене, что приводит к образованию нового опухолеспецифического антигена в клетках мультиформной глиобластомы. Экспрессия этого белка обнаруживается также в клетках рака молочной железы, яичника, простаты и карцином легкого. К указанному белку получены моноклональные антитела, которые проявляют высокую специфическую активность против мутантного vIIIR EGF. Установлено также, что делеции vIIIR EGF обнаруживаются не только при перечисленных выше опухолях, но и при злокачественных опухолях мозга. Получены различные синтетические пептиды с высокой комплементарностью к указанному рецептору, что дает основание рассматривать его как мишень для различных воздействий.

Заслуживают внимания интересные факты, свидетельствующие о том, что мутации гена рецептора EGF способствуют взаимодействию последнего с другими ростовыми факторами, что предполагает возможность использования антител против этого мутантного белка для связывания с опухолевой мишенью. Указанные мутации усиливают туморогенностъ in vivo, свидетельствуют об укорочении периода ремиссии и связаны, в основном, с повреждением δ-цепи EGFR.

Каспаза-8 (CASP-8). Мутации гена CASP-8 выявлены при исследовании клеток меланомы и карциномы почек. Антигены, кодирующиеся этим геном (FLICE или МАСН), участвуют в индукции апоптоза Fas-зависимым путем. Такие мутации не выявляются в нормальных клетках и, в отличие от других мутантных антигенов, частота их экспрессии опухолевыми клетками сравнительно незначительна. ЦТЛ распознают антигенный пептид CASP-8, который презентируется HLA-B*3503. Мутации в гене, который кодирует CASP-8. обнаружены по изменениям в пяти аминокислотах, в то время как мутации генов MUM-1, cDK-4 и β-катенина выявлены только по изменениям в одной аминокислоте. Авторы полагают, что подобно точечным мутациям в указанных выше генах мутации CASP-8 играют важную роль в опухолевой прогрессии.

Данные литературы об антигенах опухолей — продуктов мутантных генов, как показывает представленный выше материал, далеко не полны. Тем не менее, несмотря на небольшое количество идентифицированных антигенов и значительное число вопросов, на которые пока нет ответов, можно сформулировать ряд положений, которые, по-видимому, существенно не изменятся.

1. Опухолевые антигены — продукты мутантных генов — характеризуются высокой специфичностью, ее стабильностью и в отличие от многих опухолеассоциированных антигенов — продуктов нормальных генов не экспрессируются нормальными клетками.

2. Мутантные антигены имеют различную природу и кодируются различными генами, подвергшимися мутации.

3. Продукты мутантных генов могут распознаваться CD4+- и СD8+Т-лимфоцитами в комплексе с соответствующими молекулами ГКГ.

4. Уникальность мутантных антигенов (высокая специфичность и ее стабильность), способность индуцировать иммунологический ответ различных антигенраспознающих клеток обосновывает преимущество их использования для вакцинации и представляется, что наибольший прогресс в иммунотерапии рака может быть достигнут в результате идентификации и последующего использования именно истинных опухолеспецифических антигенов.